Células estaminais embrionárias

A descoberta das células-tronco embrionárias não surgiu por acaso, mas sim no terreno preparado pela pesquisa científica no campo da biologia do desenvolvimento. O termo "célula-tronco" foi introduzido na medicina em 1908, no congresso da Sociedade Hematológica de Berlim, por Alexander Maximov, em relação às células hematopoiéticas. Muito antes do isolamento e da produção de linhagens estáveis de células-tronco embrionárias pluripotentes, as células-tronco teratogênicas (células-tronco de embrião-carcinoma) eram utilizadas em estudos de processos iniciais de desenvolvimento, com a ajuda dos quais mecanismos desconhecidos da embriogênese eram estudados, incluindo a sequência de expressão de genes iniciais e os produtos proteicos de sua atividade.

Mas a totipotência do genoma humano se perde irremediavelmente no processo evolutivo? Não, e a embriogênese é prova disso. Se for assim, então quando, em princípio, o segundo caminho do desenvolvimento evolutivo será realizado? Provavelmente, quando o homem entrar no espaço, onde as condições ambientais serão relativamente constantes por um tempo suficientemente longo. A perda de tecido ósseo (desmineralização dos ossos em estado de ausência de peso), que está sujeito muito lentamente à remodelação e regeneração, pode ser considerada o primeiro passo no processo de adaptação do homem, como espécie, à existência em condições espaciais. No entanto, o preço do segundo caminho do desenvolvimento evolutivo será diferente – o preço do retorno da totipotência e da plasticidade absoluta a todas as células será a esterilidade. Portanto, neste mundo de "camaleões evolucionários", teremos que nos reproduzir sem meiose, por brotamento. Mas viveremos muito tempo. A imortalidade da telomerase é a imortalidade de uma ameba. Em um organismo multicelular, as células-tronco são o substrato da longevidade quantitativa e qualitativa.

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Fontes de células-tronco embrionárias

Atualmente, as fontes de células-tronco embrionárias para pesquisa laboratorial são linhagens de teratocarcinoma murino (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) e teratocarcinoma humano (clone NTERA-2, TERA-2, H-9), bem como linhagens de células-tronco embrionárias (CES) Trauneon. No entanto, a disponibilidade de um passaporte celular detalhado indicando o fenótipo imunológico, resultados de análises cromossômicas, perfis de expressão de mRNA, receptores expostos e proteínas de sinalização intracelular não compensa as deficiências significativas das linhagens de células-tronco embrionárias (CES) de teratocarcinoma – rápida perda de totipotência e a impossibilidade de seu uso em ensaios clínicos, enquanto a diferenciação mista em cultura dificulta muito o isolamento de uma linhagem especializada pura de uma população celular heterogênea. Portanto, a fonte de linhas ESC criadas para fins clínicos geralmente é a massa celular interna do blastocisto, blastômeros individuais de embriões em estágio de 8 células, células de mórula de estágios posteriores, bem como células germinativas primordiais.

Deve-se notar que as células de teratocarcinoma, embora possuam a propriedade de pluripotência, são caracterizadas por um potencial pluripotente significativamente menor em comparação com as CTEs. Sua integração com células embrionárias raramente leva à formação de quimeras, que, além disso, nunca formam gametas com o genótipo das células de teratocarcinoma. Acredita-se que isso se deva à ocorrência frequente de anormalidades cromossômicas durante o cultivo de células de teratocarcinoma: perda do cromossomo Y, diversas trissomias, deleções ou translocações.

Tentativas de isolar uma linhagem de CTE humanas foram feitas repetidamente, mas essa tarefa não foi resolvida, uma vez que blastocistos humanos normais são de difícil acesso. Além disso, a frequência de anormalidades cromossômicas em humanos é maior do que na embriogênese animal. A esmagadora maioria dos embriões humanos iniciais obtidos após fertilização in vitro exibem mosaicismo cromossômico caótico e frequentemente apresentam aberrações numéricas e estruturais. Mesmo posteriormente, no estágio de blastocisto, apenas 20-25% dos embriões humanos consistem em células com cariótipo normal. Era virtualmente impossível usar esses embriões para criar CTEs, uma vez que os zigotos eram geralmente cultivados até o estágio de dois ou quatro blastômeros e então transplantados para o útero. Apenas recentemente foi desenvolvida uma técnica confiável para cultivar óvulos humanos fertilizados até o estágio de blastocisto. A introdução dessa técnica na prática da fertilização in vitro não apenas aumentou a frequência de resultados bem-sucedidos de implantação, mas também tornou os blastocistos normais um objeto mais acessível.

Outra fonte de células-tronco pluripotentes são as células germinativas primordiais, que, diferentemente das populações progenitoras mais avançadas do epitélio germinativo, não possuem beta-integrina em sua superfície, mas expressam alta atividade de fosfatase alcalina. Deve-se notar que populações de células-tronco formadas a partir de células germinativas primordiais têm sido estudadas experimentalmente desde a década de 1980. Naquela época, foi desenvolvida uma técnica para isolar células germinativas primordiais do rudimento da gônada do embrião de camundongo. Os primeiros resultados malsucedidos do cultivo de células germinativas primordiais in vitro sugeriram a futilidade dessas tentativas, uma vez que as células, embora sobrevivessem, não proliferaram e morreram no primeiro dia. Posteriormente, foi estabelecido que as células germinativas primordiais de camundongo se reproduzem in vitro apenas na presença de fatores de crescimento polipeptídicos específicos solúveis e ligados à membrana no meio de cultura. Os resultados de numerosos estudos mostraram que, para a sobrevivência e proliferação de células germinativas primárias, é necessária a presença não apenas de fatores de crescimento de LIF, mas também de fatores de crescimento de Steel solúveis e ligados à membrana (SIF) no meio de cultura. Esses peptídeos são produzidos por células somáticas de embriões homozigotos para a mutação Steel, e um deles é um ligante do proto-oncogene cKit.

As células germinativas primárias de mamíferos e humanos têm origem extragonadal e são a fonte do desenvolvimento clonal da linhagem de células germinativas. A origem da linhagem de células germinativas primordiais, assim como de todos os tecidos embrionários e do mesoderma extraembrionário, é o epiblasto (ectoderma primário) dos embriões iniciais, que possui uma organização estrutural em mosaico. Utilizando o método de remoção microcirúrgica de várias partes do embrião inicial, foi estabelecida uma zona de localização no epiblasto do clone de precursores comprometidos de células germinativas primordiais. Utilizando rodamina dextrana, que foi usada como marcador celular, foi estabelecido que os precursores de células germinativas primordiais estão localizados na região proximal do epiblasto, próximo ao ectoderma extraembrionário. A linhagem de células germinativas primordiais surge de um clone de 45 células, cuja alocação ocorre logo no início da gastrulação. Em seguida, o clone se segrega e, durante a gastrulação, as células germinativas primárias entram no mesoderma extraembrionário e são encontradas na base do rudimento do alantoide, atrás da linha primária. De lá, as células germinativas primárias migram em direção à parte ventral do endoderma do intestino posterior e, em seguida, movem-se ativamente ao longo do mesentério, povoando as cristas genitais ao final da migração. Durante a migração, bem como nos primeiros 2 a 3 dias de localização no rudimento gonadal, as células germinativas primárias proliferam ativamente e passam por oito ciclos replicativos. Se no início da migração houver cerca de 50 células germinativas primárias, então nas cristas genitais de embriões de camundongo com doze dias de desenvolvimento o número de células germinativas primárias excede 25.000.

A similaridade funcional das CTEs e das células germinativas primordiais é evidenciada pela integração completa destas últimas ao blastocisto, com a substituição da massa celular interna e o subsequente desenvolvimento completo do embrião, cujos tecidos consistem apenas dos descendentes das células germinativas primordiais. Em outras propriedades, as células germinativas primordiais de camundongo também se mostraram idênticas às CTEs, demonstrando a capacidade de se diferenciar em diversas direções, formar corpos embrionários in vitro e formar teratomas in vivo quando administradas por via subcutânea a camundongos imunodeficientes, assemelhando-se a teratomas testiculares espontâneos em camundongos 129/ter.

Foi descoberto que quando LIF, SIF ligado à membrana e solúvel são adicionados ao meio, células germinativas primárias isoladas de embriões de camundongos de 8 dias de idade sobrevivem e se reproduzem na cultura por 4 dias, mas depois morrem. Além disso, o período em que a morte das células germinativas primárias é observada na cultura coincide com o estágio de desenvolvimento dos embriões de camundongos (12,5-13,5 dias), quando as células germinativas primárias femininas entram em meiose nos rudimentos das gônadas, e as divisões mitóticas são bloqueadas nas células germinativas primárias masculinas. No entanto, se não apenas os fatores de crescimento LIF e SIF, mas também o FGF2 forem adicionados ao meio, as células germinativas primárias continuam a proliferar, e colônias de células capazes de se multiplicar mesmo após a remoção dos fatores de crescimento (SIF e FGF) do meio são formadas nas subculturas. Essas células podem ser cultivadas por um longo tempo em um substrato de fibroblastos embrionários sem a adição do fator de crescimento solúvel LIF. Foi proposto chamar essas linhagens celulares estáveis obtidas de células germinativas primordiais de células germinativas embrionárias. Este termo não é de todo bem-sucedido, visto que é impossível obter células germinativas embrionárias capazes de realizar as etapas subsequentes de ovogênese ou espermatogênese durante o cultivo de células EG. Isso se deve ao fato de que as linhagens celulares EG, embora se originem de células germinativas primordiais, ao adquirirem as propriedades de células-tronco pluripotentes embrionárias em cultura, perdem a capacidade de se vincular a linhagens germinativas. Em outras palavras, as células germinativas primordiais, quando cultivadas, perdem as propriedades de precursoras de gametas e são transformadas em células pluripotentes semelhantes às CCE.

Observou-se que teratomas não surgem quando células EG são introduzidas em camundongos imunodeficientes. Supõe-se que a perda da capacidade das células EG humanas de originar teratomas se deva ao fato de que essas linhagens não foram criadas diretamente a partir de células germinativas primárias cultivadas, mas sim obtidas de células isoladas de corpos embrionários. Portanto, é possível que sejam descendentes de células pluripotentes, mas já comprometidas.

Deve-se notar que existem diferenças fundamentais entre células EG e células germinativas primordiais. Estas últimas não permitem a obtenção de embriões quiméricos de camundongos, o que indica a incapacidade das células germinativas primordiais de se integrarem à massa celular interna ou trofectoderma. As características da população de células germinativas primordiais são mais semelhantes às de linhagens comprometidas de células somáticas de embriões posteriores, cuja introdução no blastocisto também não leva à formação de embriões quiméricos.

A modificação da técnica de cultivo de corpos embrionários obtidos por agregação de células EG possibilitou a obtenção de outra população de células pluripotentes, denominadas "células derivadas de corpos embrionários" (células EBD), por meio de seleção em meios seletivos. A capacidade das células EBD de proliferarem em cultura por um longo período possibilitou a criação de linhagens celulares estáveis de células comprometidas. Clones de células que expressam uma ampla gama de marcadores de mRNA e proteínas de células especializadas foram obtidos. Essa abordagem provou, em última análise, que as células germinativas primárias humanas são pluripotentes e se diferenciam in vitro em diferentes tipos celulares: neurônios, neuróglia, endotélio vascular, células hematopoiéticas, células musculares e endodérmicas.

Fontes alternativas de células-tronco embrionárias

Uma fonte alternativa de linhagens de ESC humanas pode ser células híbridas. A implantação, no útero de vacas pseudogestantes, de uma construção heterogênea obtida pela fusão por eletroporação de células somáticas do feto humano com um óvulo bovino do qual o pronúcleo foi previamente removido permite a obtenção de uma massa celular interna a partir de um embrião artificial em estágios de desenvolvimento pré-implantação. Para tanto, na primeira etapa, um blastocisto é obtido a partir de um óvulo bovino com um núcleo de célula humana transplantado.

Na segunda etapa, um embrioblasto é isolado do blastocisto e, a partir dele, as CTEs são isoladas usando o método de Thomson. Vale ressaltar que os melhores resultados no isolamento de linhagens de CTEs usando esse método foram obtidos usando núcleos de células foliculares ou células germinativas primárias que permanecem no corpo humano em estado de hibernação. Isso se deve ao fato de que os núcleos de células humanas transplantadas para um óvulo de vaca devem ter telômeros não encurtados e alta atividade telomeásica, o que ajuda a evitar o envelhecimento prematuro de clones de CTEs obtidos de um óvulo híbrido (Repin, 2001). Sabe-se que as proteínas marcadoras intracelulares mais importantes de CTEs são Oct3, Oct4, Tcf e Groucho, que pertencem às chamadas proteínas silenciadoras de cromatina. Os silenciadores fornecem um pacote particularmente compacto de heterocromatina, o que impede a formação de alças de eucromatina. O empacotamento da cromatina mediado por essas proteínas se correlaciona com a totipotência do genoma das CTEs. Até o momento, foi estabelecido que oócitos bovinos e humanos maduros são o único tipo de célula especializada que contém altas concentrações de proteínas silenciadoras no citoplasma. Com base nisso, foi desenvolvido um método para a obtenção de CTEs híbridas por meio da transferência de núcleos de células somáticas para oócitos bovinos enucleados. Estudos preliminares in vitro demonstraram que o citoplasma de oócitos bovinos restaura a totipotência do genoma do núcleo de células somáticas humanas após 12 a 24 horas de cultivo.

De particular interesse são os dados sobre as peculiaridades do desenvolvimento pré-implantação de embriões humanos, que indicam uma substituição mais tardia de células totipotentes por uma população de células pluripotentes do que em camundongos. Um estudo de transformações celulares mostrou que as células trofoblásticas também surgem das células da massa celular interna de blastocistos humanos, além das CCEs, o que indica sua potência total.

Sabe-se que no estágio de blastocisto surgem duas populações celulares distintamente comprometidas. Uma delas forma a camada externa do blastocisto - o trofectoderma, cujos derivados são as células do trofoblasto e outros componentes embrionários da placenta. A segunda população de células é agrupada em uma massa densa em contato com a superfície interna do trofectoderma. Os derivados da população de células da massa celular interna são todos os tecidos e rudimentos dos órgãos do embrião. No estágio de blastocisto tardio, o endoderma extraembrionário é formado a partir da massa celular interna e o epiblasto (ectoderma primário) é formado. Nesse caso, as células do epiblasto retêm pluripotência, enquanto a capacidade de diferenciar células do endoderma extraembrionário é limitada.

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Obtenção de células-tronco embrionárias humanas

Até recentemente, acreditava-se que era impossível obter CTEs do trofoblasto. No entanto, uma linhagem de células-tronco trofoectodérmicas diploides isoladas de um blastocisto prolifera e se transforma em células-tronco em um meio contendo FGF2 e heparina em vez de LIF. Se o FGF2 for removido do meio, as células trofoectodérmicas param de se multiplicar, a endoreduplicação cromossômica começa nelas e os elementos celulares do trofoblasto gradualmente se transformam em células trofoblásticas gigantes. Provavelmente, o LIF não estimula a proliferação de células trofoblásticas devido ao fato de o FGF2 desencadear um mecanismo de trans-sinalização diferente, uma vez que o FGF2, ao se ligar ao receptor plasmático (FGFR2), ativa as MAP cinases no citoplasma - ERK1 e ERK2. Consequentemente, quando uma via de sinalização (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) é ativada nas células do blastocisto, as células da massa celular interna são transformadas em CCEs pluripotentes, e quando o segundo mecanismo de transdução de sinal transmembrana (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) é ativado, células-tronco do trofectoderma são formadas no blastocisto. A escolha da via de sinalização, por sua vez, depende da atividade do gene oct4. Este gene, que pertence ao domínio POU, está localizado no locus t do autossomo 17 e é expresso durante a ovogênese, durante o período de clivagem, bem como nas células da massa celular interna do blastocisto e nas células germinativas primárias. O papel funcional do gene oct4 é codificar um fator de transcrição necessário para o surgimento de células pluripotentes, sua diferenciação e desdiferenciação.

A expressão do gene oct4 em CTEs varia dependendo da interação desse fator de transcrição com cofatores. A regulação direcionada da expressão de oct4 em blastocistos mostrou que, quando sua atividade é reduzida, metade das células forma trofectoderma, enquanto quando a expressão induzida de oct4 aumenta, predominantemente CTEs surgem.

No experimento, as CCEs não podem ser transferidas para uma linhagem durante o cultivo de blastômeros totipotentes no estágio de clivagem, bem como no estágio de gastrulação e em estágios posteriores do desenvolvimento embrionário. As CCEs de camundongo são geralmente isoladas no 3,5-4,5º dia de gestação, o que corresponde ao sexto (blastocisto de camada única) e sétimo estágios (blastocisto de duas camadas - cilindro de ovo inicial) da embriogênese normal. Obviamente, somente no período de pré-implantação os embriões de camundongo contêm populações celulares capazes de se transformar em CCEs. Consequentemente, o isolamento de linhagens de CCEs é possível apenas em certos estágios da embriogênese. O zigoto e os blastômeros que surgem durante a clivagem são totipotentes, do ponto de vista da possibilidade de desenvolver um embrião viável com membranas embrionárias e placenta. A perda da potência total das células germinativas começa no estágio tardio da mórula, quando o comprometimento posterior dos blastômeros depende de sua localização. Os blastômeros de mórula iniciais mantêm a totipotência, uma vez que manipulações experimentais com mudanças em sua localização, como a inversão de sua localização, não impedem o desenvolvimento de um embrião completo.

Foi estabelecido que a eficiência do isolamento de CTEs em uma linhagem é afetada pela condição dos blastocistos no momento de sua explantação. O uso de blastocistos após a modelagem de uma diapausa de sete dias no trato reprodutivo de camundongos ovariectomizados no 3,5º dia de gestação e tratados com progesterona facilita o isolamento mais bem-sucedido de linhagens de células-tronco embrionárias. Supõe-se que, nessas condições, o número de blastômeros que formam a massa celular interna aumente. Também é possível que o ciclo celular seja prolongado e a maioria dos blastômeros entre na fase G0.

Além disso, a criação de linhagens de CTE pluripotentes estáveis depende do genótipo dos embriões: CTEs são facilmente isoladas de blastocistos da linhagem 129 de camundongos, são muito mais difíceis de obter usando camundongos CS7BL/6 e é virtualmente impossível isolar uma linhagem de CTEs de blastocistos de camundongos CBA/Ca. Obviamente, embriões em estágio inicial apresentam algumas características genéticas que afetam o desenvolvimento de uma linhagem de CTEs pluripotentes. No entanto, durante o cultivo de epiblastos isolados, bem como por seleção seletiva de células em diferenciação, linhagens de CTEs foram isoladas de embriões em estágio inicial de camundongos CBA/Ca.

Uma técnica padrão comprovada para a obtenção de linhagens de ESC a partir de blastocistos é apresentada em manuais de laboratório sobre a técnica de experimentos com embriões em estágio inicial. Linhagens experimentais de ESC também podem ser obtidas por meio do cultivo de epiblasto isolado (ectoderma primário) de embriões de camundongos com 4,5 dias de idade, utilizando uma técnica microcirúrgica bastante complexa e condições de cultivo modificadas. A complexidade desse procedimento se justifica, visto que a frequência de formação de linhagens de ESC, neste caso, revelou-se significativamente maior do que em trabalhos com a massa celular interna do blastocisto.

Para isolar linhagens de CCE, cada clone é transferido para um micropoço, um agregado de 40 a 60 células é cultivado e, em seguida, disperso novamente. Múltiplas repetições desse procedimento nos permitem obter uma linhagem de CCE imortalizada com a máxima taxa de proliferação de células normocarióticas aderidas ao plástico, que retêm a totipotência e a alta atividade da telomerase após 50 a 100 passagens. No processo de manutenção de linhagens de CCE, o maior perigo é a contaminação do meio ou soro com endotoxinas bacterianas - mesmo concentrações residuais de endotoxina no meio de cultura causam morte em massa de células germinativas imaturas. Com o monitoramento cuidadoso do crescimento linear e a dispersão oportuna, as CCE em cultura são capazes de divisão simétrica, na qual ambas as células-filhas permanecem pluripotentes e capazes de realizar um número ilimitado de ciclos celulares, mantendo um cariótipo diploide e potência total.

A seleção de uma população pura de CTEs humanas pode ser realizada após a transfecção de seu genoma com moléculas de DNA recombinante contendo o gene que codifica a síntese da proteína fluorescente verde (GFP). A expressão da GFP aumenta quando as CTEs são cultivadas em condições favoráveis à sua proliferação, enquanto com o início da diferenciação, o nível de expressão desse gene diminui, o que permite a seleção de linhagens celulares pluripotentes puras e estáveis em um meio seletivo. Ao cultivar CTEs isoladas por meio da seleção por GFP, a frequência de formação de colônias aumenta significativamente, uma vez que o poderoso efeito antiproliferativo das células diferenciadas é eliminado nas condições de cultivo por seleção.

A tradução de células-tronco embrionárias humanas em uma linhagem é realizada usando o método de isolamento de embriões pré-implantação (no estágio de 80-120 células), que permanecem após o procedimento de fertilização in vitro. Para este propósito, embriões "excedentes" obtidos artificialmente são dispersos mecanicamente no meio Delbecco-Eagle. Após a marcação das células com anticorpos monoclonais seletivos com um marcador fluorescente, as células embrioblásticas são isoladas. O embrioblasto é disperso em células individuais usando uma mistura dispase-colagenase. As células dissociadas são cultivadas em um meio especial (80% meio Delbecco + 20% soro fetal bovino na presença de 500 μg/ml de IL-6, LIF e SCF) sobre uma monocamada alimentadora de fibroblastos embrionários das 3 primeiras passagens. Neste caso, a sobrevivência e a proliferação de células-tronco e progenitoras são mantidas devido ao efeito de IL-6, LIF e SCF. Em tal meio, as CTEs crescem como clones em suspensão de células em esferas não aderidas, que devem ser dissociadas por pipetagem suave e repetida. Novos clones aparecem na cultura suspensa no 5º ao 7º dia. A taxa máxima de crescimento das CTEs é alcançada pela dissociação repetida dos clones no estágio de 10 a 15 células. Em seguida, cada clone é transferido para um micropoço e cultivado até um agregado de 40 a 50 células. O procedimento é repetido muitas vezes em passagens, aumentando o volume da cultura para uma densidade de 5 a 10 milhões de células por placa de 6 cm. Usando essa passagem, Thomson isolou 10 clones imortais de CTEs humanas, que após 100 passagens mantiveram alta atividade telomerase, capacidade de proliferar vigorosamente, características fenotípicas mínimas e potência total com a capacidade de se diferenciar em qualquer uma das 350 linhagens celulares especializadas derivadas do ecto, meso e endoderma. A diferenciação das CTEs humanas teve início (após troca de meio, adição de soro e eliminação do LIF) com a adesão da célula ao substrato, indicando o desenvolvimento do citoesqueleto e a expressão de receptores de adesão. Importante ressaltar que, com proliferação ilimitada, as CTEs humanas mantiveram um cariótipo normal.

O segundo método de isolamento de linhagens de células-tronco embrionárias humanas (ESC) baseia-se no uso de células germinativas primárias. Estudos experimentais demonstraram que linhagens de células E podem ser obtidas a partir das pregas genitais de embriões de camundongos com 12,5 dias de idade. No entanto, nesses casos, a frequência de formação de linhagens de células progenitoras foi significativamente menor do que em experimentos com embriões mais jovens. Ao mesmo tempo, células germinativas primárias das gônadas de embriões de camundongos com 13,5 dias de idade gestacional não são capazes de se transformar em linhagens.

As primeiras linhagens estáveis de células EG humanas pluripotentes foram obtidas de gonócitos primários isolados das gônadas de embriões de 5 a 9 semanas de idade. As células isoladas foram cultivadas em um substrato de fibroblastos embrionários de camundongo inativados em meio DMEM com soro fetal suplementado com mercaptoetanol, forscolina e fatores de crescimento humano recombinantes (FGF e LIF). Após 7 a 12 dias, colônias multicelulares surgiram na cultura, correspondendo às células EG humanas por características morfológicas e marcadores moleculares. Após a agregação, essas células formaram corpos embrionários, com posterior desenvolvimento dos quais surgiram células especializadas características de derivados de todas as três camadas germinativas. Ao longo de 10 a 20 passagens, as linhagens de células EG mantiveram um cariótipo normal e não perderam a pluripotência.

Também foi demonstrado que a ação combinada de LIF, fatores de aço solúveis e ligados à membrana, e TGF-β altera o programa de desenvolvimento das células germinativas primordiais. Em vez de cessar as divisões mitóticas e começar a se diferenciar em direção à ovogênese ou espermatogênese, as células germinativas primordiais continuam a proliferar. Após vários ciclos mitóticos adicionais, elas se tornam semelhantes às células epiblásticas e, perdendo as propriedades de precursoras de células germinativas, são transformadas em células-tronco embrionárias pluripotentes (EG).

Assim, em 1998, linhagens imortalizadas de células germinativas primordiais foram isoladas pela primeira vez do rudimento genital de tecido de autópsia fetal humana. Na embriogênese humana, as células germinativas primordiais aparecem no saco vitelínico na 3ª semana de desenvolvimento e, na 4ª-5ª semanas, essas células migram para a zona do tubérculo genital, onde formam populações dormentes de gonócitos primários. Em um estado inativo, as células germinativas primordiais são preservadas no embrião até o nascimento. Linhagens de células germinativas primordiais são isoladas do tubérculo genital fetal de embriões de 5 a 9 semanas, cujo tecido extraído é tratado ex tempore com uma mistura de colagenases tipos IV-V, hialuronidase e DNase para aumentar o rendimento quantitativo e qualitativo das células. As células germinativas primordiais no tecido do tubérculo genital fetal são circundadas por células de Sertoli estromais (mesenquimais). A função das células de Sertoli é produzir fatores antiapoptóticos (ligante Fas), mitógenos e imunossupressores que protegem as células germinativas do ataque imunológico do organismo. Além disso, o microambiente estromal do tubérculo genital desempenha um papel importante na maturação dos gametas. As células germinativas primárias isoladas são semeadas em cultura sobre uma camada estromal alimentadora, constituída por fibroblastos fetais das três primeiras passagens. A combinação mais eficaz de mitógenos é um complexo constituído por LIF, FGF e forscolina (um estimulador da formação de AMPc). A proliferação de células germinativas primárias in vitro requer a adição de soro fetal, na presença do qual a reprodução dos gonócitos primários em cultura é acompanhada pela formação de clones de células esféricas não aderidas ao substrato.

No Instituto Nacional de Saúde dos EUA, com base em um resumo dos dados existentes sobre métodos para isolar linhagens de CTE humanas de blastocistos, chegou-se à conclusão preliminar de que o isolamento bem-sucedido de CTEs é mais provável quando se cultivam blastocistos com uma massa celular interna bem formada (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Desse ponto de vista, a fonte ideal de CTEs para a criação de linhagens são blastocistos humanos no 5º dia de desenvolvimento, dos quais o trofectoderma deve ser cuidadosamente removido ao isolar a massa celular interna. A massa celular interna isolada, composta por 30 a 35 células nesse estágio, deve ser cultivada em um substrato de fibroblastos embrionários de camundongo, o que é uma condição decisiva para a formação de colônias de CTEs em cultura.

Análise de características fenotípicas de células-tronco embrionárias

De particular interesse é a análise comparativa interespecífica das características fenotípicas das CTEs. Foi descoberto que colônias de CTEs humanas são aglomerados densos de células achatadas, semelhantes a epiteliais, enquanto corpos embrionários de camundongos consistem em um conglomerado frouxo de células arredondadas. Em CTEs humanas, o índice de razão núcleo-plasma é menor do que em CTEs de camundongos. Células-tronco embrionárias de macacos formam colônias mais achatadas de células com bordas irregulares. Células individuais são facilmente visíveis em clones iniciais de CTEs de primatas. CTEs em proliferação de todas as espécies animais estudadas não expressam moléculas de MHC de classe I e II. Ao mesmo tempo, CTEs humanas dão uma reação positiva aos anticorpos TERA 1-60 e GCTM-2, o que indica a presença de proteoglicanos de queratina/sulfato de condroitina em sua superfície, característicos de células-tronco de embrião-(terato)-carcinoma. A expressão do gene oct4 em CTEs de todas as espécies animais sugere que, apesar das diferenças fenotípicas, o mesmo conjunto de genes responsáveis pela manutenção da pluripotência é aparentemente ativado em CTEs humanas e de camundongo (Peru, 2001). Além disso, linhagens de CTEs isoladas de embriões de rato, porco, coelho, primata e bovino apresentam características morfológicas semelhantes, um conjunto semelhante de marcadores moleculares de identificação e um mecanismo molecular quase idêntico para a implementação de programas de embriogênese, o que nos permite lançar um novo olhar sobre o problema do xenotransplante.

Ao contrário da embriogênese normal in vivo, a proliferação de CTEs in vitro não é acompanhada pela formação de folhetos germinativos e ocorre em um contexto de bloqueio dos genes Hox homeóticos, ou seja, sem organogênese. Como os genes de segmentação não funcionam, é impossível reproduzir períodos da embriogênese como a postura dos somitos, a segmentação do embrião, a formação do saco vitelínico, alantoide e outros órgãos e tecidos provisórios em cultura de CTEs. As CTEs cultivadas parecem ter congelado no início do processo de formação de 350 linhagens de restrição de células especializadas. Assim, um clone de células progenitoras filhas e uma CTE localizada centralmente representam apenas um modelo de embrião, durante o desenvolvimento do qual diferentes linhagens de células especializadas são formadas simultaneamente em diferentes regiões do tecido, as quais, no entanto, se originam de precursores comuns. Apesar do nível mínimo de receptores na superfície das CTEs, elas retêm a capacidade de realizar processos morfogenéticos primitivos, imitando as estruturas volumétricas de um embrião inicial: uma suspensão de CTEs em cultura agrega-se e forma estruturas semelhantes a blastocistos ou mesmo a embriões posteriores (cilindros de ovos). Esses agregados em suspensão são chamados, respectivamente, de corpos embrioides simples e complexos.

Na diferenciação mista, genes iniciais do ectoderma (oct3, fgf-5, nodal), endoderma (gata-4), mesoderma (brachyury), mesoderma cardiogênico (pkh-2.5), tubo neural (msx3) e hematopoiese (elkf) são expressos simultaneamente em diferentes células de um corpo embrionário. Utilizando diversas combinações de fatores de crescimento e citocinas para ação direcionada na formação de células da camada germinativa in vitro, foi possível, em vários casos, obter corpos embrionários nos quais os genes do ectoderma ou do mesoderma foram expressos preferencialmente, o que abre caminho para a modelagem da gastrulação e das fases iniciais da organogênese.

O crescimento clonal de CTEs é evidência de divisão celular assimétrica, na qual apenas uma CTE no centro do clone retém potencial de proliferação ilimitado, enquanto a segunda célula-filha gera uma geração de células progenitoras que já estão em processo de diferenciação. Portanto, a taxa de proliferação do clone na periferia do corpo embrionário é maior do que no centro. As células marginais do clone em crescimento sofrem diferenciação espontânea desordenada, migram ou morrem por mecanismos apoptóticos. Esses eventos determinam o destino do clone: se a taxa de proliferação exceder a taxa de migração e morte celular por apoptose, o clone continua a aumentar de tamanho, a estabilização ocorre quando a taxa de apoptose e a taxa de formação de novas células são iguais, e a regressão ocorre quando a proporção desses processos é inversa. As células progenitoras se dividem simetricamente, ou seja, ambas as células-filhas subsequentemente se diferenciam em linhagens celulares especializadas maduras. A proporção de CTEs para células progenitoras varia, mas o número de CTEs é sempre apenas uma fração de um por cento da população de células progenitoras. Portanto, somente a pipetagem cuidadosa e a desagregação oportuna dos clones podem aumentar o número de CTEs na cultura. A desagregação dos clones no estágio de 10 a 12 células mostrou-se mais eficaz para obter o rendimento máximo de CTEs. A direção e o grau de diferenciação das células no corpo embrionário dependem de sua localização. As células externas do corpo embrionário não expressam o gene oct4 e sofrem diferenciação em células do endoderma primário, a partir das quais células semelhantes a epiteliais do endoderma extraembrionário parietal e visceral são posteriormente formadas. As células internas do corpo embrionário expressam o gene oct4 e retêm a pluripotência por 48 horas de cultivo. No entanto, a cultura é então morfologicamente reestruturada em uma monocamada epitelial e a expressão dos genes que controlam o desenvolvimento do ectoderma primário começa. Em seguida, o processo de citodiferenciação desordenada total começa com o surgimento de vários tipos celulares derivados de todas as três camadas germinativas. No processo de diferenciação espontânea das células do corpo embrionário, agregados com marcadores endodérmicos na forma de fragmentos (cistos) do saco vitelínico são os primeiros a aparecer. Em seguida, angioblastos e células endoteliais dos capilares em crescimento aparecem nessas estruturas. Nos estágios finais da diferenciação espontânea, várias células terminalmente diferenciadas se desenvolvem a partir das células internas do corpo embrionário, incluindo neurônios, elementos gliais, cardiomiócitos, macrófagos e eritrócitos. Até certo ponto (levando em consideração a inversão espacial da formação das camadas de tecido germinativo), utilizando corpos embrionários, é possível estudar processos morfogenéticos in vitro e analisar os mecanismos moleculares dos períodos iniciais da citodiferenciação embrionária.bem como estabelecer o papel de genes específicos na implementação desses processos.

Assim, dentro do clone existem células nas quais diferentes programas de desenvolvimento genético foram descobertos - CCEs, progenitores precoces e populações de progenitores em diferenciação. O cultivo de CCEs pelos métodos de gota suspensa ou cultura em massa sem uma camada de alimentação e sem adicionar LIF ao meio leva inevitavelmente à formação de corpos embrionários. A morfologia das células das camadas externa e interna dos corpos embrionários difere. A camada externa consiste em células grandes e ramificadas. Sua superfície voltada para o ambiente é coberta por numerosas microvilosidades. A camada externa de células é separada da camada interna por uma membrana basal semelhante à membrana de Reichert, enquanto as células da camada interna dos corpos embrionários são epitélio colunar. Morfologicamente, a camada interna, embora contenha muitas células em divisão, assemelha-se mais a colônias indiferenciadas de CCEs.

Características das células-tronco embrionárias humanas

A ausência de interações de sinalização parenquimatoso-mesenquimal, em um contexto de bloqueio do gene da homeose, leva ao crescimento desordenado de CTEs em cultura, uma vez que isso interrompe a formação e o desenvolvimento da infraestrutura dos órgãos provisórios. O crescimento desorganizado e a diferenciação espontânea desordenada de CTEs em cultura são devidos à ausência de marcação mesenquimal da estrutura estromal dos futuros órgãos: in vitro, é perfeitamente possível formar milhões de hepatócitos, mas é impossível obter um único lóbulo hepático que inclua elementos estruturais e funcionais como seios, espaços de Disse e células de Kupffer.

Acredita-se que a pluripotência das CTEs se realize exclusivamente na embriogênese com a formação dos tecidos e órgãos do embrião, enquanto a placenta e o cordão umbilical são derivados do trofoblasto. As CTEs encerradas na membrana trofectodérmica geram sequencialmente clones de células provisórias que implementam o programa de desenvolvimento por meio do mRNA combinatório da matriz topográfica volumétrica de Nokhteyov, que predetermina o arranjo espacial, a forma e o tamanho, o número de células dos órgãos provisórios e definitivos, bem como a montagem do parênquima em unidades estruturais e funcionais. Ao mesmo tempo, as CTEs continuam sendo o único tipo de célula em que o mecanismo molecular para a implementação de suas potências está completamente desconectado do programa de desenvolvimento genético, e as próprias CTEs são privadas da capacidade de interagir com outras células devido ao bloqueio tanto das percepções dos receptores quanto dos sistemas de transsinalização. No entanto, a ativação adequada das CTEs leva a um desenvolvimento gradual do programa de embriogênese, culminando com o nascimento de um organismo totalmente formado, composto por bilhões de células, pronto para a vida extrauterina. Nesse caminho de curto, mas inimaginavelmente longo, no espaço celular, surgem inevitavelmente erros tanto nos mecanismos moleculares que asseguram a atividade vital das células quanto nos programas que controlam sua proliferação, diferenciação e especialização. Portanto, na farmacogenômica moderna, doenças da estrutura molecular e doenças da programação celular são consideradas separadamente. Além disso, a ação da maioria dos novos fármacos visa corrigir os programas de diferenciação, proliferação e organogênese, bem como a regeneração de órgãos e tecidos. Em um organismo adulto, as CTEs permitem controlar o comportamento de células-tronco/progenitoras transplantadas para o cérebro, fígado, baço, medula óssea e outros órgãos humanos, a fim de restaurar o parênquima danificado dos órgãos do receptor, diferenciando e especializando células do doador na matriz mesenquimal preservada. Em essência, o programa de totipotência começa a ser implementado no nível dos genomas do ovócito, zigoto e blastômero; no entanto, essas células ainda não foram clonadas e passadas em quantidades necessárias para as necessidades da medicina experimental e prática. Portanto, as CCEs continuam sendo uma fonte única de informação genética contendo códigos para um mapa tridimensional do embrião e códigos para restrição linear de linhas celulares especializadas durante a gastrulação.

O potencial regenerativo virtualmente ilimitado das CTEs se deve ao fato de seu genoma, diferentemente do aparato genético de células somáticas diferenciadas, reter pluripotência. Uma das manifestações do estado dormente da informação genética incorporada nas CTEs é o chamado fenótipo mínimo – um número limitado de receptores é expresso na superfície das CTEs e, consequentemente, pouquíssimos programas de transsinalização são utilizados para a interação do aparato nuclear da célula com seu microambiente. Em um contexto de hibernação de genes responsáveis pela restrição de linhagens celulares especializadas e pela diferenciação celular, apenas cerca de 30 dos 500 genes são ativados, cujos produtos garantem a conexão da célula com o microambiente circundante. Utilizando o método de análise serial da expressão gênica, demonstrou-se que, com o trabalho conjunto das principais caixas funcionais do genoma que regulam a energética e o metabolismo em células somáticas e CCEs, estas últimas apresentam um nível muito baixo de mRNA de receptores, proteínas G, mensageiros secundários, transcriptases, cofatores de expressão e repressão, ou seja, todo o sistema de transmissão transmembrana do sinal regulatório para a célula. Isso se deve à ausência ou à expressão muito baixa de genes transsinalizadores. Durante o período de diferenciação induzida no genoma das CCEs, 18 genes funcionais param de funcionar sincronicamente em um contexto de ativação de 61 genes transsinalizadores que controlam a síntese de receptores de adesão celular, componentes da matriz extracelular, transcriptases de restrição e elementos mensageiros do sistema de transmissão de sinais para o aparato nuclear a partir dos receptores da membrana plasmática da célula. Ao mesmo tempo, a expressão de genes responsáveis pela síntese de proteínas silenciadoras é bloqueada, bem como co-inibidores da expressão gênica que garantem a totipotência do genoma das CCEs.

Marcadores genéticos foram encontrados para células de todas as três camadas germinativas. A identificação da camada de células ectodérmicas é realizada pela expressão dos genes nodal, oct3 e fgf-5, células mesodermas - pelos genes braquiúria e zetaglobina, e endodermas - pela expressão do gene gata-4. Na embriogênese normal, durante o período de gastrulação, observa-se migração ativa de populações imaturas de células-tronco e progenitoras, marcando localmente as zonas de desenvolvimento dos ossos faciais do crânio, algumas partes do cérebro, sistema nervoso periférico, sistema de condução cardíaca e timo, cujos tecidos são formados a partir de clones de células migrantes. A marcação de células por genes iniciais das camadas germinativas facilita a tarefa de análise topográfica dos processos de migração de células precursoras no embrião em desenvolvimento. Foi estabelecido, em particular, que em agregados de células de embriocarcinoma P19, a expressão do primeiro gene do mesoderma, brachyury, inicia-se durante o período de diminuição da expressão dos genes do ativador do plasminogênio tecidual, α-fetoproteína, queratina 8 e queratina 19, que são marcadores das primeiras populações migratórias do mesoderma. Consequentemente, a formação de tecidos de origem mesodérmica inicia-se somente após a conclusão do processo de migração pontual e dispersão das células progenitoras mesodérmicas.

Apesar das características fenotípicas extremamente limitadas e da ausência da maioria das unidades de trans-sinalização, as CTEs ainda expressam algumas moléculas receptoras que podem ser usadas para sua identificação. É digno de nota que antígenos marcadores de CTEs em humanos e primatas se mostraram comuns. Na maioria das vezes, anticorpos marcados para antígenos ligados à membrana SSEA-3, SSEA-4 (antígenos lipídicos únicos que representam um complexo de glicolipídeo GL7 com ácido siálico), bem como glicoproteínas de alto polímero TRA-1-81, TRA-1-60, são usados para marcação de CTEs. Além disso, as CTEs expressam o antígeno embrionário específico SSEA-1 e a fosfatase alcalina endógena, bem como o fator de transcrição específico Oct4. Este último é necessário para manter os mecanismos de proliferação de CTEs - o fator de transcrição específico Oct4 ativa a expressão do gene do fator de crescimento de fibroblastos 4 e estabiliza a expressão do conjunto de genes responsáveis pela replicação ilimitada do DNA em células imaturas. As proteínas marcadoras intracelulares mais importantes são Oct3, Oct4, Tcf e Groucho, que estão relacionadas às proteínas silenciadoras de cromatina.

Quase imediatamente após muitos anos de tentativas bem-sucedidas de cultivar CTEs fora do corpo e a obtenção das primeiras culturas de células-tronco isoladas de blastocistos de camundongos e culturas de células germinativas primárias, uma etapa da pesquisa sobre o potencial pluripotente das CTEs começou quando elas foram introduzidas em embriões em estágios iniciais de desenvolvimento. Foi demonstrado que, nos estágios de mórula e blastocisto, as CTEs são capazes de formar embriões quiméricos nos quais os descendentes das CTEs doadoras são detectados em todos os tecidos somáticos e até mesmo em gametas. Assim, na biologia do desenvolvimento, com o uso de CTEs, foi estabelecida uma "ponte" entre estudos experimentais in vivo e in vitro, o que expandiu significativamente as possibilidades de estudo dos processos de formação de tecidos e órgãos primários, sua diferenciação e organogênese embrionária.

Está claramente estabelecido que, in vivo, durante a embriogênese, as CTEs são integradas à massa celular do embrião inicial, e seus derivados são encontrados em todos os órgãos e tecidos. As CTEs colonizam uma linhagem de células germinativas no embrião quimérico, cujos descendentes formam óvulos e espermatozoides completos. As células-tronco embrionárias são clonogênicas – uma única CTE é capaz de criar uma colônia de células geneticamente idênticas com marcadores moleculares, que incluem a expressão do gene oct4 e da fosfatase alcalina, alta atividade da telomerase e expressão de certos antígenos embrionários.

Para estudar os mecanismos da embriogênese usando CTEs, um método de quimerização de mórula foi desenvolvido pela criação de uma construção biológica, fora da qual há uma camada de blastômeros tetraploides do receptor, e CTEs do doador são introduzidas em seu interior. Assim, o trofoblasto é formado a partir dos descendentes dos blastômeros tetraploides do receptor, o que garante a implantação e a placentação, e as CTEs do doador atuam como uma massa celular interna a partir da qual o corpo de um embrião viável e uma linhagem de células germinativas progenitoras primárias são formados. O valor da pesquisa das CTEs reside não apenas no fato de que a pluripotência é preservada durante manipulações in vitro com seu genoma, mas também no fato de que a capacidade das CTEs de participar da formação de células germinativas primárias de um embrião quimérico é preservada. Foi demonstrado que os descendentes de apenas uma CTE geneticamente modificada povoam todos os rudimentos primários e tecidos em desenvolvimento de um embrião quimérico obtido por agregação ou cocultivo dessa célula com um embrião de 8 células. Quando CTEs transfectadas com o gene da proteína fluorescente verde foram transplantadas para a mórula de camundongos, descendentes fluorescentes dessa célula foram encontrados em todos os tecidos estudados do embrião em desenvolvimento (Shimada, 1999). O transplante de CTEs para a mórula permite a criação de camundongos viáveis cujo organismo consiste apenas nos descendentes da CTE doadora, o que abre perspectivas para diversas opções de clonagem terapêutica. Essa abordagem metodológica é atualmente utilizada com sucesso no estudo de problemas da biologia do desenvolvimento, em particular, para analisar os mecanismos de inativação genética do cromossomo X ou a instabilidade epigenética das CTEs. O transplante de CTEs para um embrião em estágio inicial também é utilizado em biotecnologia agrícola, bem como em experimentos de terapia gênica.

O transplante de CTEs geneticamente modificadas é usado para testar células-alvo de genes mutantes. CTEs cultivadas in vitro são usadas em biotecnologia para criar camundongos knockout. Para esse propósito, o gene a ser estudado é removido das CTEs por recombinação homóloga (knockout) e as células sem esse gene são isoladas em meio seletivo. CTEs knockout são então introduzidas no blastocisto ou agregadas com blastômeros de mórula. Os embriões quiméricos iniciais obtidos dessa maneira são transplantados em fêmeas receptoras, e indivíduos com gametas nulizigotos para um determinado gene são selecionados entre os camundongos recém-nascidos. Essa tecnologia tem sido usada para criar muitas linhagens de camundongos knockout, que são amplamente utilizadas em biologia experimental e medicina experimental. Esses modelos biológicos são usados para estudar a importância de certos genes no desenvolvimento embrionário, bem como seu papel nos mecanismos de doenças humanas e condições patológicas. Além disso, linhagens animais knockout são usadas em testes pré-clínicos de novos métodos de terapia gênica. Por exemplo, transfectando o alelo normal de um gene mutante para o genoma da ESC, é possível corrigir eficazmente uma mutação que afeta o sistema hematopoiético. A introdução de genes estranhos em ESC permite a rápida criação de linhagens de animais de laboratório transgênicos homozigotos. No entanto, deve-se notar que a técnica de deleção gênica por recombinação direcionada até o momento só foi desenvolvida de forma confiável em relação a ESCs de camundongo. Usando ESCs de camundongo com knockout duplo, o papel funcional da região do cluster de genes no cromossomo 7 (uma cópia da região genômica no cromossomo 19 humano) e da região proximal do cromossomo 11 (uma cópia do cromossomo 5g humano) foi estabelecido - a deleção desses genes em ESCs de camundongo tornou possível avaliar a função de seus análogos em humanos.

As possibilidades de estudar a função dos genes da embriogênese humana se expandiram, e a transfecção para o genoma de CTEs de animais de laboratório tornou possível, em particular, esclarecer o papel do criptogene na formação e no desenvolvimento do mesoderma cardiogênico, o gene pax-6, na embriogênese ocular. Os primeiros mapas de expressão gênica em CTEs proliferantes imaturas de teratocarcinoma e blastocistos de camundongos estão sendo compilados, e a repressão supressiva de genes de transsinalização em CTEs foi confirmada. Uma combinação de 60 a 80 CTEs mutantes e 20 a 30 células de embriões normais de camundongos pré-implantados leva ao desenvolvimento de embriões quiméricos nos quais os primórdios dos órgãos consistem em células doadoras e receptoras, o que torna possível esclarecer o papel de genes desconhecidos na gastrulação e na organogênese. O mapa funcional dos genes de embriões de camundongos em desenvolvimento foi complementado por informações sobre o papel do gene sf-1 na formação da glândula adrenal e das gônadas, do gene wt-1 na formação do rim, dos genes da família myoD na formação do músculo esquelético e dos genes da família gata-1-4 na maturação de restrição dos rudimentos da eritropoiese e da linfopoiese.

A desativação direcionada de alelos maternos e paternos de genes em CTEs usando recombinases de vetores permitiu esclarecer as funções de vários genes no período inicial da embriogênese, e a tecnologia de transferência direcionada de genes humanos desconhecidos para CTEs de camundongos contribui para a descoberta de novos genes mutantes responsáveis pelo desenvolvimento de patologias hereditárias graves. Utilizando o método de knockout, foi determinada a importância obrigatória de alguns genes para a formação de tecidos embrionários: gata-4 - para o miocárdio, gata-1 - para a linhagem eritroide do tecido hematopoiético, myoD - para os músculos esqueléticos, braquiúria - para o mesoderma, transcriptases de restrição hnf3 e hnf4 - para células-tronco hepáticas, rag-2 - para a formação de clones de linfócitos T e B (Repin, 2001). A dupla deleção de genes em CTEs abriu caminho para o estudo do papel funcional dos genes da camada germinativa, segmentação e homeose, e o transplante de CTEs possibilitou a obtenção de embriões híbridos interespecíficos viáveis. Utilizando uma técnica aprimorada para o transplante de CTEs de um único doador para um embrião de 8 células, foi comprovada a quimerização em nível celular de muitos órgãos do embrião receptor. Deve-se notar que brotos celulares de tecido humano foram encontrados em órgãos de camundongos receptores após a introdução de células-tronco hematopoiéticas humanas no blastocisto. Foi estabelecido que CTEs pluripotentes circulam no sangue de embriões de camundongos durante o período de formação dos órgãos. É possível que sua função biológica resida na organização embrionária do futuro sistema imunológico. Com a ajuda de CTEs, modelos adequados de patologia genética humana foram reproduzidos em condições de laboratório: duplo knockout do gene da distrofina em modelos de distrofia muscular de Duchenne em camundongos e o desligamento do gene atm (controle da síntese da cinase sinal da cromatina) - ataxia-telangectasia. Nesta doença hereditária fatal em crianças, a degeneração das células de Purkinje no cerebelo se desenvolve devido a defeitos na reparação do DNA, que é acompanhada pela involução do timo devido à morte das células em proliferação. O quadro clínico, a fisiopatologia e a patomorfologia da ataxia-telangectasia, reproduzida pela introdução de informação genética patológica em CCEs, em camundongos quiméricos, correspondem aos encontrados em humanos. Além da ataxia-telangectasia, utilizando CCEs e camundongos knockout, foram desenvolvidos modelos experimentais de algumas doenças humanas homozigotas hereditárias associadas à patologia do metabolismo de carboidratos e lipídios, catabolismo de aminoácidos e excreção de cobre e bilirrubina, o que expandiu significativamente as capacidades da medicina experimental na fase de testes pré-clínicos de novos métodos para o tratamento das doenças humanas correspondentes.

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Uso de citohíbridos de células-tronco

Células híbridas obtidas pela fusão de CTEs com células somáticas são um modelo adequado e promissor para estudar a pluripotência de células-tronco e reprogramar os cromossomos de células diferenciadas. Cito-híbridos obtidos pela fusão de CTEs com células diferenciadas de um animal adulto permitem estudar as relações entre genomas de diferentes "idades": uma situação única surge quando cromossomos homólogos originários de células em diferentes estágios de diferenciação e diferentes graus de maturidade estão localizados no mesmo núcleo, onde podem facilmente trocar sinais regulatórios trans-atuantes. É difícil prever como os sistemas epigenéticos cisregulatórios de cromossomos homólogos, formados durante o desenvolvimento individual, reagirão à influência de sinais trans-atuantes emanados de genomas embrionários relacionados. Além disso, a segregação dos cromossomos parentais ocorre em células híbridas, o que nos permite estudar a interação dos genomas no nível de cromossomos individuais, ou seja, identificar potencialmente a participação de cromossomos específicos na manutenção da pluripotência ou, inversamente, na saída para a diferenciação.

Cito-híbridos obtidos pela fusão de células pluripotentes de teratocarcinoma e células somáticas diferenciadas foram usados como o primeiro modelo experimental para estudar a interação de genomas com diferentes "histórias de desenvolvimento". Em alguns casos, tais células híbridas mantiveram propriedades pluripotentes em um nível bastante alto. Em particular, células híbridas teratocarcinoma-somáticas induziram o desenvolvimento de teratomas verdadeiros contendo derivados de todas as três camadas germinativas in vivo e, in vitro, em culturas de suspensão, formaram corpos embrionários. Mesmo em cito-híbridos interespecíficos deste tipo, a presença de antígenos embrionários foi observada em casos em que os parceiros somáticos na fusão com células de teratocarcinoma eram linfócitos ou timócitos. É digno de nota que cito-híbridos criados pela fusão de células de teratocarcinoma com fibroblastos corresponderam a fibroblastos em fenótipo.

O fato mais importante estabelecido é que, em células híbridas de teratocarcinoma-somáticas, surgiram sinais de reprogramação do genoma celular diferenciado, caracterizado pela reativação de genes individuais ou do cromossomo X inativo do parceiro somático. Assim, os resultados de estudos com citohíbridos do tipo de célula somática de teratocarcinoma indicam que a pluripotência é frequentemente preservada em células híbridas e que há sinais de reprogramação do genoma do parceiro somático.

Em experimentos sobre a obtenção de células híbridas embrionárias intraespecíficas pela fusão de células-tronco embrionárias de camundongo com esplenócitos adultos, as características desses citohíbridos foram estudadas, a segregação dos cromossomos parentais foi analisada e a pluripotência do genoma híbrido foi avaliada. Células híbridas intraespecíficas obtidas pela fusão de células de teratocarcinoma com células somáticas são geralmente caracterizadas por um baixo nível de segregação cromossômica com um cariótipo tetraploide ou quase tetraploide. Uma composição cromossômica semelhante foi observada em citohíbridos durante a fusão de células germinativas primárias com linfócitos. Ao mesmo tempo, células híbridas interespecíficas obtidas pela fusão de células de teratocarcinoma de camundongo com linfócitos de vison mostraram intensa segregação dos cromossomos do parceiro somático.

Uma etapa qualitativamente nova no estudo da segregação de cromossomos parentais em híbridos intraespecíficos começou após o desenvolvimento de um método para analisar microssatélites usando a reação em cadeia da polimerase, graças à qual centenas de marcadores foram encontrados para cada cromossomo do camundongo, permitindo a discriminação confiável de qualquer par de cromossomos homólogos em células híbridas.

Ao fundir CTEs (células HM-1 deficientes em atividade de hipoxantina fosforribosiltransferase, 2n = 40, XY, isoladas de blastocistos de camundongos 129/01a) com esplenócitos de camundongos DD/c congênicos, foi possível obter um conjunto de clones híbridos morfologicamente semelhantes às CTEs. Todos os clones foram isolados em um meio seletivo no qual apenas células com hipoxantina fosforribosiltransferase ativa podem crescer. A análise eletroforética mostrou que todos os clones tinham uma variante alélica da hipoxantina fosforribosiltransferase característica de camundongos DD/c. A análise citogenética mostrou que três dos quatro clones híbridos tinham um conjunto quase diploide de cromossomos. Um clone quase tetraploide continha duas populações de células híbridas, uma das quais era tetraploide e a segunda, menor, era diploide.

A análise de microssatélites, que permite a discriminação de qualquer par de cromossomos homólogos de camundongos 129/01a e DD/c, em clones híbridos com um conjunto quase diploide, mostrou que em dois clones houve uma clara eliminação preferencial de autossomos do parceiro somático. A maioria dos autossomos nos clones HESS2 e HESS3 tinha marcadores da linhagem 129/01a, ou seja, o parceiro pluripotente. A exceção foram os cromossomos 1 e I: nos clones HESS2 e HESS3, juntamente com marcadores de células HM-1, marcadores do parceiro somático estavam presentes em pequenas quantidades. Tais resultados podem refletir a segregação incompleta dos cromossomos 1 e I do parceiro somático e são consistentes com dados citogenéticos de que a trissomia para esses cromossomos é observada em 30-40% das células dos clones HESS2 e HESS3. O clone HESS4 diferiu significativamente em sua composição cromossômica: muitos autossomos neste clone originaram-se do genoma da ESC (cromossomos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 e 17), mas os cromossomos 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 e 19 foram representados por homólogos de ambos os pais. A proporção quantitativa de microssatélites marcando esses cromossomos homólogos foi de aproximadamente 1:1. Isso permitiu aos autores presumir que um homólogo se originou do genoma da ESC e o outro de células diferenciadas. Em alguns subclones do clone HESS4, apenas marcadores dos cromossomos 18 e 19 do parceiro somático estavam presentes. Os resultados obtidos indicam que nas células do clone HESS4, além da segregação dos cromossomos do parceiro somático, ocorreu a eliminação de um ou ambos os homólogos dos cromossomos acima listados do genoma pluripotente, ou seja, houve uma segregação bilateral dos cromossomos de ambos os pais - um fenômeno bastante incomum, uma vez que a segregação dos cromossomos de apenas um dos pais é característica de citohíbridos.

Além disso, após a 20ª passagem, todos os clones de células híbridas continham apenas marcadores do cromossomo X do parceiro somático, ou seja, o cromossomo X da ESC foi substituído pelo cromossomo X do parceiro somático nos clones. Este fato importante é confirmado por dados de hibridização in situ usando uma sonda marcada com FITC específica para o cromossomo X do camundongo: um sinal positivo foi detectado em apenas um cromossomo. Deve-se notar que em estágios iniciais de cultivo (antes da 15ª passagem), de acordo com dados citogenéticos, muitas células continham dois cromossomos X. Portanto, o uso de meios seletivos permite manipular a composição cromossômica das células híbridas e selecionar seletivamente clones portadores de cromossomos únicos do parceiro somático contra o fundo do genoma da ESC.

Como uma característica única do genoma citohíbrido é a localização dos genomas parentais em um único núcleo, surge naturalmente a questão da preservação das propriedades pluripotentes do genoma embrionário em híbridos de células somáticas e células-tronco embrionárias (CES) sob condições de contato próximo com o genoma de uma célula diferenciada. Morfologicamente, os citohíbridos de CES e células somáticas eram semelhantes à linhagem parental de CES. A avaliação da pluripotência mostrou que todos os clones com um conjunto de cromossomos quase diploide eram capazes de formar corpos embrioides em culturas em suspensão, nas quais estavam presentes derivados das três camadas germinativas.

A maioria das células híbridas continha o antígeno ECMA-7, um marcador característico de embriões de camundongos em estágio inicial, e também apresentava alta atividade de fosfatase alcalina. Os dados mais convincentes sobre as propriedades altamente pluripotentes das células híbridas foram obtidos em experimentos com a obtenção de uma série de quimeras de injeção envolvendo células híbridas do clone HESS2. A análise de marcadores bioquímicos mostrou que os descendentes das células híbridas doadoras estavam presentes na maioria dos tecidos das quimeras. Portanto, as células híbridas obtidas pela fusão de CTEs e células somáticas diferenciadas mantêm alta pluripotência, incluindo a capacidade de formar quimeras quando injetadas na cavidade do blastocisto.

Os clones HESS2 e HESS4 diferiram significativamente na composição dos cromossomos parentais, mas apresentaram propriedades pluripotentes semelhantes. Pode-se supor que a pluripotência no genoma híbrido se manifeste como uma característica dominante, mas é possível que nem todos os cromossomos do genoma embrionário estejam envolvidos no processo de manutenção da pluripotência. Se essa suposição estiver correta, pode-se esperar que a eliminação de alguns cromossomos do parceiro pluripotente do genoma das células híbridas não seja acompanhada por uma alteração em seu status pluripotente. Nesse caso, a análise da segregação dos cromossomos parentais em células híbridas embrionárias nos permitiria aproximar-nos da identificação dos cromossomos responsáveis pelo controle da pluripotência das células embrionárias.

O. Serov et al. (2001) não encontraram nenhuma prole entre 50 descendentes obtidos pelo cruzamento de quimeras com camundongos normais que tinham o genótipo 129/01a e carregavam o cromossomo X de camundongos DD. Os autores acreditam que isso se deve a uma diminuição da pluripotência em células híbridas sob a influência do genoma somático. Uma explicação alternativa pode ser o efeito negativo da trissomia em alguns autossomos e o desequilíbrio nos cromossomos sexuais (XXY foram observados em células até a 15ª passagem) em células híbridas durante a meiose. Sabe-se que as células XXY são incapazes de passar pela meiose e formar gametas. A trissomia também pode causar uma diminuição na atividade proliferativa das células híbridas, como resultado da qual a vantagem seletiva no desenvolvimento de quimeras pode pertencer às células do embrião receptor. Conclui-se que, para uma avaliação adequada do potencial pluripotente das células híbridas, é necessário obter clones híbridos com um conjunto diploide normal de cromossomos.

Nos experimentos de O. Serov e coautores (2001), a possibilidade de reprogramar o cromossomo X de uma célula somática no genoma de células híbridas foi demonstrada pela primeira vez. Esta conclusão dos autores decorre da análise da expressão do gene hprt (um marcador do cromossomo X) em quimeras: a presença da variante alélica de hprt de camundongos DD/c foi detectada em todos os tecidos quiméricos analisados. É apropriado enfatizar que, após a introdução de células híbridas na cavidade do blastocisto, os citohíbridos caem em condições não seletivas e a preservação do cromossomo X no genoma de células híbridas significa que ele se tornou seu componente obrigatório e o genoma não o discrimina do cromossomo Y do parceiro pluripotente.

Resumindo os resultados da análise da interação dos genomas somático e pluripotente em células embrionárias híbridas, os autores concluem que, em alguns citohíbridos, a pluripotência se manifesta como uma característica dominante. O genoma híbrido é capaz de reprogramar cromossomos individuais de células diferenciadas, o que, no entanto, não exclui a possibilidade de um efeito reverso do genoma somático sobre a pluripotência do genoma embrionário. Ao cultivar células híbridas, a indução da diferenciação ocorre significativamente mais frequentemente do que na linhagem parental original de CTEs HM-1. Um efeito semelhante é observado durante a formação de colônias primárias: muitas colônias primárias de células híbridas embrionárias se diferenciam em estágios iniciais de formação, com grandes perdas de clones durante sua seleção e reprodução.

Assim, citohíbridos criados pela fusão de CTEs com células somáticas, apesar do contato próximo com o genoma de células diferenciadas, retêm a pluripotência como uma propriedade única do genoma embrionário. Além disso, em tais células híbridas, a reprogramação de cromossomos individuais originários de células diferenciadas é possível. Ainda não está claro até que ponto as propriedades pluripotentes do genoma embrionário são retidas em células híbridas, em particular, sua capacidade de participar da formação da linha germinativa em quimeras. Isso requer a obtenção de células híbridas embrionárias com um cariótipo normal. De qualquer forma, células híbridas embrionárias pluripotentes podem se tornar um modelo genético real para identificar cromossomos envolvidos na manutenção da pluripotência ou no seu controle, uma vez que a segregação bilateral dos cromossomos parentais potencialmente oferece tal oportunidade.

Não menos atraente é o estudo do fenômeno que O. Serov et al. (2001) definem como "memória cromossômica". No genoma híbrido, os cromossomos homólogos estão em duas configurações alternativas: os homólogos do parceiro somático já passaram por diferenciação, enquanto nos homólogos do parceiro pluripotente esse processo está apenas começando. Consequentemente, a preservação de altas propriedades pluripotentes por células híbridas indica que a configuração "pluripotente" dos homólogos de ESC é suficientemente estável no genoma híbrido, apesar da influência de fatores transacionais emanados do parceiro somático. Os sinais acima descritos de reprogramação de cromossomos homólogos do genoma diferenciado durante o desenvolvimento de quimeras não excluem a possibilidade de que nos primeiros estágios de formação e cultivo de citohíbridos in vitro eles retenham seu status adquirido durante a diferenciação in vivo. De acordo com dados obtidos recentemente, quando células híbridas embrionárias são transferidas para um ambiente não seletivo, elas apresentam eliminação intensiva de cromossomos apenas do parceiro somático, ou seja, o genoma das células híbridas discrimina facilmente homólogos após cultivo in vitro por 10 a 15 passagens. Assim, as células híbridas embrionárias representam um modelo experimental promissor para o estudo não apenas de uma propriedade fundamental do genoma embrionário, como a pluripotência, mas também de sua alternativa: a diferenciação embrionária.

Eficácia terapêutica do transplante de células-tronco embrionárias

Antes de analisar a eficácia terapêutica do transplante de CTEs e seus derivados, resumimos o material acima. As capacidades das CTEs em termos de implementação completa da embriogênese in vitro são insuficientes, uma vez que os defeitos de desenvolvimento, neste caso, são devidos à ausência de células-tronco mesenquimais, que surgem no corpo de forma autônoma e independente das CTEs. O potencial genético das CTEs é menor que o potencial genético do zigoto, portanto, as CTEs não são usadas diretamente para clonagem de embriões. O potencial biológico único das CTEs como as únicas células nas quais os programas de desenvolvimento são totalmente implantados em uma implementação consistente é usado em estudos de função genética. Com a ajuda das CTEs, as primeiras combinações de sinais que ativam a expressão de genes precoces e tardios que codificam o desenvolvimento das três camadas germinativas são decodificadas. A preservação da pluripotência do genoma das CTEs in vitro as torna uma ferramenta única para a regeneração reparadora, capaz de repor automaticamente as perdas celulares em caso de danos a órgãos e tecidos. Em um cenário hipotético ideal, pode-se supor que “... ao transplantar CCEs do doador, programas compactados são transferidos para o corpo do receptor, os quais, sob condições favoráveis, são realizados na construção de novo tecido'7, capaz de “... ser efetivamente integrado ao corpo do receptor tanto no nível morfológico quanto funcional.”

Naturalmente, após o desenvolvimento de métodos para monodiferenciação de CTEs, iniciou-se o estudo in vivo da atividade funcional de células obtidas in vitro a partir de um clone especializado. Um clone de CTE em proliferação gera populações de células progenitoras migratórias que são verdadeiramente capazes de se integrar ativamente em áreas de dano tecidual receptor, o que é usado na medicina regenerativa-plástica. Foi estabelecido que o transplante de neurônios DOPA na substância negra reduz as manifestações clínicas no hemiparkinsonismo experimental. Transplantes regionais de células-tronco neurais de doadores reduzem o grau de distúrbios motores causados por trauma ou contusão da medula espinhal e do cérebro. Os primeiros resultados positivos do transplante de células-tronco em doenças desmielinizantes também foram obtidos. Parece que o potencial regenerativo-plástico das CTEs abre possibilidades ilimitadas para o uso do transplante de células na medicina prática. No entanto, quando transplantadas em zonas ectópicas, as CTEs inevitavelmente se transformam em tumores. Teratomas são formados quando CTEs são injetadas subcutaneamente em camundongos imunodeficientes. Quando suspensões de CCE são transplantadas sob a cápsula testicular em camundongos singênicos, também se formam teratomas, constituídos por diferentes tecidos, cujas células são derivadas das três camadas germinativas. Nesses teratomas, processos de organogênese reduzida são extremamente raros.

Diversos estudos fornecem informações sobre os resultados positivos do transplante de derivados de CTEs precoces em animais com patologia experimental. O neurotransplante celular utilizando derivados de CTEs está sendo desenvolvido em experimentos e nos primeiros ensaios clínicos para corrigir distúrbios funcionais em lesões cerebrais e medulares, bem como para tratar siringomielia e esclerose múltipla (Repin, 2001). Com o advento da técnica de neurogênese in vitro a partir de CTEs, em vez de utilizar tecido cerebral embrionário, estão sendo desenvolvidos métodos para o transplante de derivados de neuroesferas obtidos de culturas de tecido nervoso embrionário. Essas suspensões para transplante são significativamente mais homogêneas e contêm precursores comprometidos de neurônios e neuroglia.

Com a adição regular de ácido retinoico na dose de 10 μg/ml ao meio de cultura por 6 semanas, mais de 80% dos neurônios pós-mitóticos são formados na linhagem de embrião-(terato)-carcinoma humano NTERA-2. A homogeneidade completa da população neuronal é alcançada pela triagem de fluxo de neurônios maduros marcados com marcadores imunofenotípicos, o que permite a eliminação de restos de teratocarcinoma e células imaturas. Após o transplante para várias regiões do cérebro de animais experimentais, esses neurônios não apenas sobrevivem, mas também se integram às redes neurais regionais. Em animais com modelos experimentais de defeitos locais do SNC, o neurotransplante reduz as manifestações clínicas de patologias humanas, como as consequências de traumatismo cranioencefálico, acidente vascular cerebral, doenças desmielinizantes, defeitos hereditários no desenvolvimento do cerebelo e doenças de deposição de lipídios e polissacarídeos.

Para otimizar os processos de regeneração em doenças degenerativas do sistema nervoso central, estão sendo desenvolvidas tecnologias para a obtenção de oligodendrócitos produtores de mielina a partir de células-tronco embrionárias (CTEs). A primeira etapa tradicionalmente inclui a proliferação de CTEs com a reprodução do número de células necessárias para o transplante. Na segunda etapa, ocorre a diferenciação direcionada das células em uma população de precursores de oligodendrócitos produtores de mielina, controlada por antígenos marcadores seletivos.

Certas perspectivas estão se abrindo para o uso de derivados de ESC para o desenvolvimento de métodos para corrigir imunodeficiências causadas por defeitos genéticos na maturação do timo. Em estudos com camundongos knockout (rag 1) com um defeito genético induzido – uma interrupção do mecanismo de recombinação dos loci V(D)J dos genes TCR, levando à perda da função dos linfócitos T – o transplante de derivados de ESC precoces no timo de animais restaura a maturação de populações normais de clones imunes responsáveis pela imunidade celular. Ensaios clínicos de transplante de ESC pré-formadas in vitro para o tratamento de anemias hereditárias fatais em crianças estão em andamento.

As objeções à rápida introdução do transplante de células-tronco na clínica baseiam-se no número limitado de linhagens estáveis de células-tronco embrionárias humanas e na necessidade de sua padronização. Para aumentar a pureza das linhagens padronizadas de células-tronco embrionárias humanas (CES), bem como das células-tronco humanas adultas, propõe-se a utilização de um método de seleção de linhagens baseado na análise genética molecular de repetições curtas de DNA em tandem. Também é necessário testar as linhagens de células-tronco embrionárias quanto à presença de pequenos rearranjos cromossômicos e mutações genéticas, cujo potencial de ocorrência em condições de cultura celular é bastante elevado. Apresenta-se uma tese sobre a obrigatoriedade de testes das propriedades de todos os tipos de células-tronco embrionárias (CES) e células-tronco pluripotentes regionais, uma vez que sua reprodução in vitro pode levar ao surgimento de novas características que não são inerentes às células-tronco embrionárias ou aos tecidos definitivos. Em particular, presume-se que o cultivo a longo prazo em meios com citocinas aproxima as linhagens de células-tronco embrionárias das células tumorais, uma vez que sofrem alterações semelhantes nas vias de regulação do ciclo celular com a aquisição da capacidade de realizar um número ilimitado de divisões celulares. Alguns autores, com base no potencial de desenvolvimento tumoral, consideram o transplante de derivados de células-tronco embrionárias precoces em humanos imprudente. Na opinião deles, é muito mais seguro utilizar descendentes comprometidos de CTEs, ou seja, linhagens de progenitores celulares diferenciados. No entanto, atualmente, ainda não foi desenvolvida uma técnica confiável para obter linhagens celulares humanas estáveis que se diferenciem na direção desejada.

Assim, cada vez mais dados sobre o efeito terapêutico positivo do transplante de derivados de células-tronco embrionárias humanas estão aparecendo na literatura. No entanto, muitos desses estudos estão sendo revisados e criticados. Alguns pesquisadores acreditam que os resultados dos primeiros ensaios clínicos são de natureza preliminar e apenas indicam que as células-tronco são capazes de exercer um efeito favorável no curso clínico de uma doença específica. Portanto, é necessário obter dados sobre os resultados remotos do transplante de células. Os estágios de desenvolvimento da neurotransplantologia clínica são citados como um argumento. De fato, a princípio, as publicações sobre a alta eficiência do transplante de fragmentos cerebrais embrionários na doença de Parkinson prevaleceram na literatura, mas então começaram a aparecer relatórios negando a eficácia terapêutica do tecido nervoso embrionário ou fetal transplantado para o cérebro de pacientes.

Os primeiros ensaios clínicos foram conduzidos para avaliar a segurança do transplante de neuroblastos derivados de células-tronco embrionárias de teratocarcinoma NTERA-2, cujas células imaturas foram submetidas à proliferação em cultura até o acúmulo de 100 milhões de massa celular. Algumas das células obtidas dessa maneira foram usadas para caracterizar o fenótipo e determinar impurezas celulares, bem como para testar possível contaminação com vírus e bactérias. O LIF e a camada de alimentação de células estromais fetais foram removidos do meio de cultura, e condições foram criadas para a diferenciação direcionada de células-tronco embrionárias de teratocarcinoma em neuroblastos usando uma combinação de citocinas e fatores de crescimento. Em seguida, os neuroblastos foram purificados de células imaturas de teratocarcinoma em um classificador de células de fluxo. Após a purificação secundária e a caracterização do fenótipo das células transplantadas, uma suspensão de neuroblastos (10-12 milhões) foi injetada no núcleo basal do cérebro dos pacientes (no sétimo mês após o AVC hemorrágico) usando uma microcânula especial e seringa sob controle estereotáxico e de tomografia computadorizada. Após o transplante, a triagem de um ano para as consequências do transplante de neurônios na zona do AVC não revelou quaisquer efeitos colaterais ou indesejáveis. Metade dos pacientes apresentou melhora na função motora no período de 6 a 12 meses após o transplante. As mudanças clínicas positivas foram acompanhadas por aumento do suprimento sanguíneo para a zona do AVC após o transplante de células: o aumento médio na absorção de 2-desoxiglicose marcada com fluorescência, de acordo com a tomografia por emissão de pósitrons, atingiu 18% e, em alguns pacientes, 35%.

No entanto, os Institutos Nacionais de Saúde dos EUA conduziram um estudo independente sobre a eficácia clínica do neurotransplante em pacientes com parkinsonismo. Os pacientes do primeiro grupo foram transplantados com seções de tecido nervoso embrionário que produzem dopamina, enquanto o segundo grupo de pacientes foi submetido a uma operação simulada. Os resultados indicam eficácia clínica zero desse neurotransplante, apesar do fato de os neurônios embrionários produtores de dopamina terem sobrevivido nos cérebros dos receptores. Além disso, 2 anos após o transplante de tecido nervoso embrionário, 15% dos pacientes desenvolveram discinesia persistente, ausente nos pacientes do grupo placebo (Células-tronco: progresso científico e direções futuras de pesquisa. Instituto Nacional de Saúde. EUA). As observações sobre o desenvolvimento posterior da doença nesses pacientes estão em andamento.

Alguns autores associam os dados contraditórios da literatura sobre a avaliação da eficácia clínica do neurotransplante a diferentes abordagens para a seleção de grupos de pacientes, escolha inadequada de métodos para avaliar objetivamente sua condição e, mais importante, diferentes períodos de desenvolvimento do tecido nervoso embrionário e diferentes áreas do cérebro das quais esse tecido foi obtido, diferentes tamanhos de transplante e características metodológicas da intervenção cirúrgica.

Deve-se notar que tentativas de transplante direto de células-tronco embrionárias pluripotentes para a região estriada do cérebro de ratos com hemiparkinsonismo experimental foram acompanhadas pela proliferação de células-tronco embrionárias (CTEs) e sua diferenciação em neurônios dopaminérgicos. Deve-se presumir que os neurônios recém-formados foram efetivamente integrados às redes neurais, visto que, após o transplante de CTEs, foi observada correção de anomalias comportamentais e assimetria motora no teste da apomorfina. Ao mesmo tempo, alguns animais morreram devido à transformação das CTEs transplantadas em tumores cerebrais.

Especialistas das Academias Nacional e Médica dos EUA, especialistas do Instituto Nacional de Saúde dos EUA acreditam que o potencial clínico das CCEs merece a mais séria atenção, mas insistem na necessidade de um estudo detalhado de suas propriedades, a probabilidade de complicações e consequências a longo prazo em experimentos em modelos biológicos adequados de doenças humanas (Células-tronco e a futura medicina regenerativa, National Academy Press.; Células-tronco e as futuras direções de pesquisa, Nat. Inst., of Health USA).

Deste ponto de vista, é importante que uma análise histológica comparativa de teratomas experimentais obtidos por transplante de suspensão de CTE no testículo com teratomas formados como resultado do transplante de um embrião inicial, que também contém CTE, tenha mostrado que as CTE, independentemente de sua fonte de origem ou interação com certas células circundantes, implementam seu potencial tumorigênico da mesma maneira. Foi comprovado que tais teratomas têm origem clonal, uma vez que tumores consistindo de derivados de todas as três camadas germinativas podem surgir de uma CTE (Rega, 2001). É digno de nota que, quando CTE clonadas com um cariótipo normal foram transplantadas em camundongos imunodeficientes, teratomas consistindo de diferentes tipos de células somáticas diferenciadas também foram formados. Esses dados experimentais são uma prova impecável da origem clonal dos teratomas. Do ponto de vista da biologia do desenvolvimento, eles indicam que não múltiplas células progenitoras comprometidas, mas uma única célula-tronco pluripotente atua como fonte de derivados diferenciados de todas as três camadas germinativas que compõem um teratoma. No entanto, no caminho para o transplante prático de células, os resultados desses estudos são, se não um sinal proibitivo, então um sinal de alerta de perigo potencial, uma vez que a inoculação de CTEs ou células germinativas primordiais em vários tecidos de camundongos adultos imunodeficientes inevitavelmente causa o desenvolvimento de tumores a partir das células-tronco transplantadas. A degeneração neoplásica de CTEs transplantadas ectopicamente é acompanhada pelo surgimento de populações satélites de células diferenciadas - devido à diferenciação parcial de CTEs e clones progenitores em linhagens especializadas. Curiosamente, quando CTEs são transplantadas para músculos esqueléticos, os neurônios são mais frequentemente formados próximos às células de teratocarcinoma. No entanto, a introdução de CTEs em um óvulo em divisão ou blastocisto é acompanhada pela integração completa das células no embrião sem a formação de elementos neoplásicos. Nesse caso, as CTEs são integradas em praticamente todos os órgãos e tecidos do embrião, incluindo o primórdio genital. Esses animais alofeno foram obtidos pela primeira vez pela introdução de células de teratocarcinoma 129 em embriões iniciais nos estágios de 8 a 100 células. Em camundongos alofênicos, populações de células heterogêneas derivadas de CCEs doadoras são integradas aos tecidos da medula óssea, intestino, pele, fígado e genitais, o que possibilita a criação de quimeras celulares interespecíficas no experimento. Quanto menor o período de desenvolvimento do embrião inicial, maior a porcentagem de quimerização celular, com o maior grau de quimerização observado no sistema hematopoiético, pele, sistema nervoso, fígado e intestino delgado do embrião alofênico. Em um organismo adulto, os tecidos protegidos do sistema imunológico do receptor por barreiras histohemáticas são suscetíveis à quimerização:O transplante de células germinativas primárias para o parênquima testicular é acompanhado pela incorporação de células-tronco do doador na camada de tecido germinativo do receptor. No entanto, ao transplantar CTEs em um blastocisto, a formação de rudimentos quiméricos dos órgãos sexuais com a geração de células germinativas primárias do doador não ocorre. A pluripotência das CTEs, quando condições especiais são criadas, também pode ser utilizada para clonagem: o transplante de CTEs de camundongo em um embrião de camundongo de 8 a 16 células, no qual as mitoses celulares são bloqueadas pela citocalsina, promove a implementação da embriogênese normal com o desenvolvimento de um embrião a partir de CTEs do doador.

Portanto, uma alternativa ao transplante alogênico de CTE é a clonagem terapêutica baseada no transplante de núcleos de células somáticas em um óvulo enucleado para criar um blastocisto, de cuja massa celular interna são isoladas linhagens de CTEs geneticamente idênticas ao doador do núcleo somático. Tecnicamente, essa ideia é bastante viável, uma vez que a possibilidade de criar linhagens de CTEs a partir de blastocistos obtidos após o transplante de núcleos somáticos em óvulos enucleados tem sido repetidamente comprovada em experimentos com animais de laboratório (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Em particular, em camundongos homozigotos para a mutação do gene rag2, fibroblastos obtidos pelo cultivo de células de tecido subepidérmico foram usados como doadores de núcleos, que foram transplantados para oócitos enucleados. Após a ativação do oócito, o "zigoto" foi cultivado até a formação do blastocisto, de cuja massa celular interna as CTEs foram isoladas e transferidas para uma linhagem de células nulizigotas para o gene mutante (rag2~/~). A mutação de um gene alélico foi corrigida em tais CTEs pelo método de recombinação homóloga. Na primeira série de experimentos, corpos embrionários foram obtidos de CTEs com um gene recombinante restaurado, suas células foram transfectadas com um retrovírus recombinante (HoxB4i/GFP) e, após a reprodução, foram injetadas na veia de camundongos rag2~/~. Na segunda série, blastômeros tetraploides foram agregados com CTEs geneticamente modificadas e transplantados em fêmeas receptoras. Os camundongos imunocompetentes resultantes serviram como doadores de medula óssea para transplante em camundongos mutantes rag2~/~. Em ambas as séries, o resultado foi positivo: após 3-4 semanas, células mieloides e linfoides normais maduras, capazes de produzir imunoglobulinas, foram encontradas em todos os camundongos. Assim, o transplante de núcleos de células somáticas em oócitos pode ser usado não apenas para obter linhagens de CTEs, mas também para citogenoterapia - correção de anomalias hereditárias, usando CTEs como vetor para transporte de informação genética corretiva. Mas essa direção do transplante de células, além dos problemas bioéticos, tem suas limitações. Não está claro quão seguro será o transplante de células clonadas terapeuticamente com genótipo idêntico ao de um paciente específico, uma vez que tais células podem introduzir mutações que criam uma predisposição a outras doenças. Óvulos humanos normais continuam sendo um objeto de difícil acesso, enquanto, mesmo com o transplante de núcleos somáticos em óvulos animais enucleados, apenas 15 a 25% dos "zigotos" construídos desenvolvem-se até o estágio de blastocisto. Ainda não está determinado quantos blastocistos são necessários para obter uma linhagem de CTEs pluripotentes clonadas. Também vale a pena notar o alto nível de custos financeiros associados à complexidade da metodologia de clonagem terapêutica.

Em conclusão, deve-se notar que em CTEs, a pluripotência do genoma com DNA hipometilado é combinada com alta atividade telomerase e uma curta fase C^ do ciclo celular, o que garante sua reprodução intensiva e potencialmente infinita, durante a qual as CTEs retêm um conjunto diploide de cromossomos e um conjunto "juvenil" de características fenotípicas. O crescimento clonal de CTEs em cultura não interfere em sua diferenciação em qualquer linhagem celular especializada do organismo quando a proliferação é interrompida e sinais regulatórios apropriados são adicionados. A diferenciação de restrição de CTEs em linhagens de células somáticas in vitro é realizada sem a participação do mesênquima, ignorando os Nochteys, fora da organogênese e sem formação de embriões. A introdução ectópica de CTEs in vivo inevitavelmente leva à formação de teratocarcinomas. O transplante de CTEs em um blastocisto ou embrião inicial é acompanhado por sua integração com os tecidos embrionários e quimerização estável de seus órgãos.

Tecnologias regenerativas-plásticas baseadas em transplante de células são o ponto de intersecção de interesses de representantes da biologia celular, biologia do desenvolvimento, genética experimental, imunologia, neurologia, cardiologia, hematologia e muitos outros ramos da medicina experimental e prática. Os resultados mais importantes de estudos experimentais comprovam a possibilidade de reprogramação de células-tronco com uma alteração direcionada em suas propriedades, o que abre perspectivas para o controle dos processos de citodiferenciação usando fatores de crescimento – para regeneração miocárdica, restauração de lesões do SNC e normalização da função do aparelho das ilhotas pancreáticas. No entanto, para a ampla introdução do transplante de derivados de CTE na medicina prática, é necessário estudar as propriedades das células-tronco humanas em mais detalhes e continuar os experimentos com CTE em modelos experimentais de doenças.

Questões bioéticas e o problema da rejeição de um transplante alogênico de células poderiam ser resolvidos pela descoberta da plasticidade do genoma de células-tronco regionais de um organismo adulto. No entanto, a informação inicial de que, ao transplantar células autólogas hematopoiéticas isoladas e cuidadosamente caracterizadas para o fígado, das quais novos hepatócitos são derivados, integrando-se aos lóbulos hepáticos, está sendo revisada e criticada. No entanto, foram publicados dados de que o transplante de células-tronco neurais para o timo causa a formação de novos brotos de linfócitos T e B do doador, e o transplante de células-tronco neurais cerebrais para a medula óssea leva à formação de brotos hematopoiéticos com mielo e eritropoiese do doador a longo prazo. Consequentemente, células-tronco pluripotentes capazes de reprogramar o genoma para o potencial de CTEs podem persistir nos órgãos de um organismo adulto.

A fonte de obtenção de CCE para fins médicos continua sendo o embrião humano, o que predetermina a inevitabilidade de uma nova intersecção de questões morais, éticas, legais e religiosas no ponto de origem da vida humana. A descoberta das CCE deu um poderoso impulso à retomada de discussões acirradas sobre onde está a linha entre células vivas e matéria, ser e personalidade. Ao mesmo tempo, não existem normas, regras e leis universais sobre o uso de CCE na medicina, apesar das repetidas tentativas de criá-las e adotá-las. Cada estado, dentro da estrutura de sua legislação, resolve esse problema de forma independente. Por sua vez, médicos em todo o mundo continuam a tentar levar a medicina regenerativa-plástica para além do escopo dessas discussões, principalmente por meio do uso de reservas de células-tronco adultas em vez de células-tronco embrionárias.

Um pouco da história do isolamento de células-tronco embrionárias

Células de terato(embrio)carcinoma foram isoladas de teratomas testiculares espontâneos de camundongos 129/ter-Sv, de teratomas ovarianos espontâneos de camundongos Lt/Sv e de teratomas derivados de células ou tecidos embrionários transplantados ectopicamente. Entre as linhagens celulares estáveis de terato(embrio)carcinoma de camundongo obtidas dessa maneira, algumas eram pluripotentes, outras se diferenciavam em apenas um tipo celular específico e algumas eram completamente incapazes de citodiferenciação.

Em determinado momento, o foco estava em estudos cujos resultados indicavam a possibilidade de retornar células de terato(embrião)-carcinoma a um fenótipo normal após sua introdução nos tecidos de um embrião em desenvolvimento, bem como no trabalho de criação in vitro de células de terato(embrião)-carcinoma geneticamente modificadas, com a ajuda das quais camundongos mutantes foram obtidos para modelagem biológica de patologia hereditária humana.

O cultivo em suspensão condicionada foi utilizado para isolar linhagens celulares de terato(embrião)-carcinoma. Em cultura, células de terato(embrião)-carcinoma, assim como as CTEs, crescem para formar corpos embrioides e requerem dissociação obrigatória para transferência de linha, mantendo a pluripotência em uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários ou durante o cultivo em suspensão em meio condicionado. Células de linhagens pluripotentes de terato(embrião)-carcinoma são grandes, esféricas, caracterizadas por alta atividade de fosfatase alcalina, formam agregados e são capazes de diferenciação multidirecional. Quando introduzidas em um blastocisto, agregam-se à mórula, o que leva à formação de embriões quiméricos, na composição de vários órgãos e tecidos dos quais são encontrados derivados de células de terato(embrião)-carcinoma. No entanto, a esmagadora maioria desses embriões quiméricos morre no útero e, nos órgãos de quimeras recém-nascidas sobreviventes, células estranhas são raramente detectadas e em baixa densidade. Ao mesmo tempo, a incidência de tumores (fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, outros tipos de tumores malignos e adenoma pancreático) aumenta acentuadamente, e a degeneração tumoral geralmente ocorre durante o período de desenvolvimento intrauterino de embriões quiméricos.

A maioria das células de terato(embrio)carcinoma no microambiente de células embrionárias normais adquire quase naturalmente características neoplásicas malignas. Acredita-se que a malignidade irreversível se deva à ativação de proto-oncogenes no processo de rearranjos estruturais. Uma das exceções são as células da linhagem de embriocarcinoma SST3, obtidas de teratomas testiculares de camundongos (linhagem 129/Sv-ter), que apresentam alta capacidade de integração aos tecidos e órgãos do embrião sem subsequente formação de tumor em camundongos quiméricos. Derivados de linhagens celulares de terato(embrio)carcinoma em camundongos quiméricos praticamente não participam da formação de gonócitos primários. Aparentemente, isso se deve à alta frequência de aberrações cromossômicas características da maioria das linhagens de terato(embrio)carcinoma, em cujas células são observadas tanto aneuploidia quanto anormalidades cromossômicas.

Várias linhagens estáveis de células de terato(embrio)carcinoma humano caracterizadas por pluripotência, alta atividade proliferativa e capacidade de diferenciação durante o crescimento em culturas foram obtidas em condições de laboratório. Em particular, a linhagem de células de terato(embrio)carcinoma humano NTERA-2 foi usada para estudar os mecanismos de citodiferenciação neural. Após o transplante de células dessa linhagem na região subventricular do prosencéfalo de ratos recém-nascidos, sua migração e neurogênese foram observadas. Tentativas foram feitas até mesmo para transplantar neurônios obtidos pelo cultivo de células da linhagem de terato(embrio)carcinoma NTERA-2 para pacientes com acidente vascular cerebral, o que, de acordo com os autores, levou a uma melhora no curso clínico da doença. Ao mesmo tempo, não houve casos de malignidade de células transplantadas da linhagem de terato(embrio)carcinoma NTERA-2 em pacientes com acidente vascular cerebral.

As primeiras linhagens de células-tronco embrionárias pluripotentes indiferenciadas de camundongo foram obtidas no início da década de 1980 por Evans e Martin, que as isolaram da massa celular interna do blastocisto – o embrioblasto. As linhagens de células-tronco embrionárias isoladas mantiveram a pluripotência e a capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares sob a influência de fatores em um meio de cultura especial por um longo período.

O próprio termo “célula-tronco pluripotente embrionária” pertence a Leroy Stevens, que, ao estudar o efeito do alcatrão do tabaco na incidência de desenvolvimento tumoral, chamou a atenção para a ocorrência espontânea de teratocarcinoma testicular em camundongos lineares (129/v) do grupo controle. As células de teratocarcinomas testiculares foram caracterizadas por uma alta taxa de proliferação e, na presença de fluido da cavidade abdominal, diferenciaram-se espontaneamente com a formação de neurônios, queratinócitos, condrócitos, cardiomiócitos, bem como fragmentos de cabelo e osso, mas sem quaisquer sinais de citoarquitetura ordenada do tecido correspondente. Quando colocadas em cultura, as células de teratocarcinoma cresceram como clones pluripotentes não aderidos ao substrato e formaram corpos embrioides, após os quais cessaram a divisão e sofreram diferenciação espontânea desordenada em neurônios, glia, células musculares e cardiomiócitos. Stevens descobriu que o teratocarcinoma 129/v de camundongo contém menos de 1% de células capazes de se diferenciar em uma variedade de linhagens somáticas especializadas, e a diferenciação em si depende dos fatores que as afetam (a composição do fluido peritoneal, produtos de células maduras ou tecidos adicionados à cultura). A hipótese de Leroy Stevenson sobre a presença de células progenitoras embrionárias da linhagem germinativa entre as células de teratocarcinoma foi confirmada: uma suspensão de células embrioblásticas de embriões pré-implantados nos tecidos de camundongos adultos formou teratocarcinomas, e linhagens celulares puras isoladas delas após administração intraperitoneal em animais receptores diferenciaram-se em neurônios, cardiomiócitos e outras células somáticas derivadas de todas as três camadas germinativas. Em experimentos in vivo, o transplante de CTEs (obtidas do embrioblasto, mas não do trofoblasto) em embriões de camundongo de outra linhagem nos estágios de blastômero 8-32 resultou no nascimento de animais quiméricos (sem o desenvolvimento de tumores), em cujos órgãos foram encontrados brotos de tecido do doador. O quimerismo foi observado até mesmo na linhagem de células germinativas.

Células germinativas progenitoras primárias isoladas do rudimento genital de um embrião de camundongo correspondiam em morfologia, fenótipo imunológico e características funcionais às CTEs obtidas por Stevenson a partir de teratocarcinoma e embrioblasto. Em quimeras nascidas após a introdução de CTEs em um blastocisto, a morfogênese alofeno dos órgãos foi caracterizada por uma alternância em mosaico de unidades estruturais e funcionais doadoras e receptoras do fígado, pulmões e rins. Em alguns casos, foi observada a formação de criptas intestinais ou lóbulos hepáticos constituídos por células receptoras e doadoras. No entanto, a morfogênese sempre foi realizada de acordo com o programa genético da espécie à qual o receptor pertencia, e o quimerismo limitou-se exclusivamente ao nível celular.

Foi então estabelecido que a proliferação de CTEs sem citodiferenciação em uma camada alimentadora de células derivadas do mesênquima (fibroblastos fetais) ocorre com a presença obrigatória de LIF em meios nutrientes seletivos, que garantem seletivamente a sobrevivência apenas de células-tronco e progenitoras, enquanto a esmagadora maioria dos elementos celulares especializados morre. Usando tais métodos, em 1998, James Thomson isolou cinco linhagens imortalizadas de células-tronco embrionárias da massa celular interna de um blastocisto humano. No mesmo ano, John Gerhart desenvolveu um método para isolar linhagens imortais de CTEs do tubérculo genital de embriões humanos de quatro a cinco semanas de idade. Devido às suas propriedades únicas, apenas dois anos depois, células-tronco embrionárias e células-tronco de tecidos definitivos começaram a ser usadas na prática da medicina regenerativa e da terapia gênica.