Células estaminais hematopoiéticas do saco vitelino

Obviamente, os diversos potenciais proliferativos e de diferenciação das células-tronco hematopoiéticas são determinados pelas peculiaridades de seu desenvolvimento ontogenético, uma vez que até mesmo a localização das principais áreas de hematopoiese muda em humanos durante a ontogênese. As células progenitoras hematopoiéticas do saco vitelínico fetal estão comprometidas com a formação de uma linhagem celular exclusivamente eritropoiética. Após a migração das HSCs primárias para o fígado e o baço, o espectro de linhagens de comprometimento se expande no microambiente desses órgãos. Em particular, as células-tronco hematopoiéticas adquirem a capacidade de gerar células da linhagem linfoide. No período pré-natal, as células progenitoras hematopoiéticas atingem a zona de localização final e povoam a medula óssea. Durante o desenvolvimento intrauterino, o sangue fetal contém um número significativo de células-tronco hematopoiéticas. Por exemplo, na 13ª semana de gestação, o nível de HSCs atinge 18% do número total de células sanguíneas mononucleares. Posteriormente, observa-se uma diminuição progressiva do seu conteúdo, mas mesmo antes do nascimento, a quantidade de HSCs no sangue do cordão umbilical difere pouco da sua quantidade na medula óssea.

De acordo com conceitos clássicos, a mudança natural na localização da hematopoiese durante o desenvolvimento embrionário de mamíferos ocorre pela migração e introdução em um novo microambiente de células-tronco hematopoiéticas pluripotentes – do saco vitelínico para o fígado, baço e medula óssea. Como nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário o tecido hematopoiético contém um grande número de células-tronco, que diminui à medida que o feto amadurece, o tecido hematopoiético do fígado embrionário, isolado de material abortado entre 5 e 8 semanas de gestação, é considerado o mais promissor para a obtenção de células-tronco hematopoiéticas.

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Perguntas sobre a origem das células-tronco hematopoiéticas

Não há dúvida de que a formação embrionária de eritrócitos se origina nas ilhas sanguíneas do saco vitelínico. No entanto, o potencial de diferenciação in vitro das células hematopoiéticas do saco vitelínico é muito limitado (elas se diferenciam principalmente em eritrócitos). Deve-se notar que o transplante de células-tronco hematopoiéticas do saco vitelínico não é capaz de restaurar a hematopoiese por um longo período. Descobriu-se que essas células não são as precursoras das HSCs adultas. As HSCs verdadeiras aparecem mais cedo, na 3ª-5ª semana de desenvolvimento intrauterino, na zona de formação do tecido gástrico e endotélio dos vasos sanguíneos (esplancnopleura paraaórtica, P-SP), bem como no lugar da aorta, gônadas e rins primários - no mesonefro ou na chamada região AGM. Foi demonstrado que as células da região AGM são uma fonte não apenas de HSCs, mas também de células endoteliais dos vasos sanguíneos, bem como de osteoclastos envolvidos nos processos de formação do tecido ósseo. Na 6ª semana de gestação, as células progenitoras hematopoiéticas iniciais da região AGM se movem para o fígado, que continua sendo o principal órgão hematopoiético do feto até o nascimento.

Como este ponto é extremamente importante do ponto de vista do transplante de células, o problema da origem das HSCs no processo de embriogênese humana merece uma apresentação mais detalhada. As ideias clássicas de que as células-tronco hematopoiéticas de mamíferos e aves se originam de uma fonte extraembrionária baseiam-se nos estudos de Metcalf e Moore, que foram os primeiros a utilizar métodos de clonagem de HSCs e seus descendentes isolados do saco vitelínico. Os resultados de seu trabalho serviram de base para a teoria da migração, segundo a qual as HSCs, tendo surgido primeiro no saco vitelínico, povoam sequencialmente os órgãos hematopoiéticos transitórios e definitivos à medida que o microambiente correspondente é formado neles. Foi assim que se estabeleceu o ponto de vista de que a geração de HSCs, inicialmente localizadas no saco vitelínico, serve como base celular para a hematopoiese definitiva.

As células progenitoras hematopoiéticas do saco vitelínico pertencem à categoria das células progenitoras hematopoiéticas mais precoces. Seu fenótipo é descrito pela fórmula AA4.1+CD34+c-kit+. Ao contrário das HSCs maduras da medula óssea, elas não expressam antígenos Sca-1 e moléculas de MHC. Parece que o aparecimento de antígenos marcadores nas membranas superficiais das HSCs do saco vitelínico durante o cultivo corresponde à sua diferenciação durante o desenvolvimento embrionário com a formação de linhagens hematopoiéticas comprometidas: o nível de expressão dos antígenos CD34 e Thy-1 diminui, a expressão de CD38 e CD45RA aumenta e as moléculas HLA-DR aparecem. Com a subsequente especialização in vitro induzida por citocinas e fatores de crescimento, inicia-se a expressão de antígenos específicos para células progenitoras hematopoiéticas de uma determinada linhagem celular. No entanto, os resultados do estudo da hematopoiese embrionária em representantes de três classes de vertebrados (anfíbios, aves e mamíferos) e, em particular, a análise da origem das HSCs responsáveis pela hematopoiese definitiva na ontogênese pós-natal, contradizem os conceitos clássicos. Foi estabelecido que, em representantes de todas as classes consideradas, duas regiões independentes nas quais as HSCs surgem são formadas durante a embriogênese. A região extraembrionária "clássica" é representada pelo saco vitelínico ou seus análogos, enquanto a zona intraembrionária recentemente identificada de localização das HSCs inclui o mesênquima paraaórtico e a região AGM. Hoje, pode-se argumentar que, em anfíbios e aves, as HSCs definitivas se originam de fontes intraembrionárias, enquanto em mamíferos e humanos, a participação das HSCs do saco vitelínico na hematopoiese definitiva ainda não pode ser completamente excluída.

A hematopoiese embrionária no saco vitelínico é, na verdade, eritropoiese primária, que se caracteriza pela preservação do núcleo em todos os estágios da maturação dos eritrócitos e pela síntese de hemoglobina do tipo fetal. De acordo com os dados mais recentes, a onda de eritropoiese primária termina no saco vitelínico no 8º dia de desenvolvimento embrionário. É seguida por um período de acúmulo de células progenitoras eritroides definitivas - BFU-E, que são formadas exclusivamente no saco vitelínico e aparecem pela primeira vez no 9º dia de gestação. No próximo estágio da embriogênese, as células progenitoras eritroides definitivas - CFU-E, bem como (!) mastócitos e CFU-GM já estão formadas. Esta é a base para o ponto de vista de que as células progenitoras definitivas surgem no saco vitelínico, migram com a corrente sanguínea, se instalam no fígado e iniciam rapidamente a primeira fase da hematopoiese intraembrionária. De acordo com esses conceitos, o saco vitelínico pode ser considerado, por um lado, como o local da eritropoiese primária e, por outro, como a primeira fonte de células progenitoras hematopoiéticas definitivas no desenvolvimento embrionário.

Foi demonstrado que células formadoras de colônias com alto potencial proliferativo podem ser isoladas do saco vitelínico já no oitavo dia de gestação, ou seja, muito antes do fechamento do sistema vascular do embrião e do saco vitelínico. Além disso, as células com alto potencial proliferativo obtidas in vitro do saco vitelínico formam colônias cujo tamanho e composição celular não diferem dos parâmetros correspondentes do crescimento cultural de células-tronco da medula óssea. Ao mesmo tempo, ao retransplantar células formadoras de colônias do saco vitelínico com alto potencial proliferativo, são formadas significativamente mais células-filhas formadoras de colônias e células progenitoras multipotentes do que ao utilizar células progenitoras da medula óssea da hematopoiese.

Uma conclusão final sobre o papel das células-tronco hematopoiéticas do saco vitelínico na hematopoiese definitiva pode ser fornecida pelos resultados do trabalho em que os autores obtiveram uma linhagem de células endoteliais do saco vitelínico (G166), que efetivamente suportou a proliferação de suas células com as características fenotípicas e funcionais de HSCs (AA4.1+WGA+, baixa densidade e propriedades adesivas fracas). O conteúdo deste último aumentou mais de 100 vezes quando cultivado em uma camada alimentadora de células C166 por 8 dias. Macrófagos, granulócitos, megacariócitos, células blásticas e monócitos, bem como células precursoras de linfócitos B e T foram identificados em colônias mistas cultivadas em uma subcamada de células C166. As células do saco vitelínico que cresceram em uma subcamada de células endoteliais tiveram a capacidade de se autorreproduzir e resistiram a até três passagens nos experimentos dos autores. A restauração da hematopoiese com a ajuda deles em camundongos adultos com imunodeficiência combinada grave (SCID) foi acompanhada pela formação de todos os tipos de leucócitos, bem como de linfócitos T e B. No entanto, os autores, em seus estudos, utilizaram células do saco vitelínico de um embrião de 10 dias, no qual os sistemas vasculares extra e intraembrionário já estão fechados, o que não nos permite excluir a presença de HSCs intraembrionárias entre as células do saco vitelínico.

Ao mesmo tempo, a análise do potencial de diferenciação de células hematopoiéticas em estágios iniciais de desenvolvimento, isoladas antes da unificação dos sistemas vasculares do saco vitelino e do embrião (8-8,5 dias de gestação), revelou a presença de precursores de células T e B no saco vitelino, mas não no corpo do embrião. No sistema in vitro, pelo método de cultivo em dois estágios em uma monocamada de células epiteliais e subepiteliais do timo, as células mononucleares do saco vitelino se diferenciaram em linfócitos pré-T e linfócitos T maduros. Sob as mesmas condições de cultivo, mas em uma monocamada de células estromais do fígado e da medula óssea, as células mononucleares do saco vitelino se diferenciaram em células pré-B e linfócitos IglVT-B maduros.

Os resultados desses estudos indicam a possibilidade de desenvolvimento de células do sistema imunológico a partir do tecido extraembrionário do saco vitelínico, e a formação de linhagens primárias de células T e B depende de fatores do microambiente estromal dos órgãos hematopoiéticos embrionários.

Outros autores também demonstraram que o saco vitelínico contém células com potencial para diferenciação linfoide, e os linfócitos resultantes não diferem em características antigênicas daqueles encontrados em animais sexualmente maduros. Foi estabelecido que as células do saco vitelínico de um embrião de 8 a 9 dias de idade são capazes de restaurar a linfopoiese no timo atimócito com o surgimento de linfócitos CD3+CD4+ e CD3+CD8+ maduros, que possuem um repertório formado de receptores de células T. Assim, o timo pode ser povoado por células de origem extraembrionária, mas é impossível excluir a provável migração de células precursoras de linfócitos T precoces de fontes intraembrionárias de linfopoiese para o timo.

Ao mesmo tempo, o transplante de células hematopoiéticas do saco vitelínico para receptores adultos irradiados nem sempre resulta em repovoamento a longo prazo das zonas de localização do tecido hematopoiético depletado, e as células do saco vitelínico in vitro formam significativamente menos colônias esplênicas do que as células da região AGM. Em alguns casos, utilizando células do saco vitelínico de um embrião de 9 dias de idade, ainda é possível obter repovoamento a longo prazo (até 6 meses) do tecido hematopoiético em receptores irradiados. Os autores acreditam que as células do saco vitelínico com o fenótipo CD34+c-kit+ não apenas não diferem daquelas da região AGM em sua capacidade de repovoar órgãos hematopoiéticos depletados, mas também restauram a hematopoiese de forma mais eficaz, visto que o saco vitelínico contém quase 37 vezes mais delas.

Deve-se notar que os experimentos utilizaram células hematopoiéticas do saco vitelínico com antígenos marcadores de células-tronco hematopoiéticas (c-kit+ e/ou CD34+ e CD38+), que foram injetadas diretamente no fígado ou na veia abdominal da prole de camundongos fêmeas que receberam uma injeção de bussulfano no 18º dia de gestação. Nesses animais recém-nascidos, sua própria mielopoiese foi drasticamente suprimida devido à eliminação de células-tronco hematopoiéticas causada pelo bussulfano. Após o transplante de células-tronco hematopoiéticas do saco vitelínico, elementos formados contendo o marcador do doador - glicerofosfato desidrogenase - foram detectados no sangue periférico dos receptores por 11 meses. Foi descoberto que as HSCs do saco vitelínico restauram o conteúdo de células da linhagem linfoide, mieloide e eritroide no sangue, timo, baço e medula óssea, e o nível de quimerismo foi maior no caso de administração intra-hepática do que intravenosa de células do saco vitelínico. Os autores acreditam que as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) do saco vitelínico de embriões em estágio inicial (até 10 dias) requerem interação preliminar com o microambiente hematopoiético do fígado para povoar com sucesso os órgãos hematopoiéticos de receptoras adultas. É possível que haja um estágio único de desenvolvimento na embriogênese, quando as células do saco vitelínico, migrando inicialmente para o fígado, adquirem a capacidade de povoar o estroma dos órgãos hematopoiéticos de receptoras maduras.

A este respeito, deve-se notar que o quimerismo de células do sistema imunológico é frequentemente observado após o transplante de células da medula óssea para receptores maduros irradiados - no sangue destes últimos, células do fenótipo do doador são encontradas em quantidades relativamente grandes entre os linfócitos B, T e granulócitos do receptor, o que continua por pelo menos 6 meses.

As células hematopoiéticas em mamíferos são detectadas pela primeira vez por métodos morfológicos no 7º dia de desenvolvimento embrionário e são representadas por ilhas hematopoiéticas dentro dos vasos do saco vitelínico. No entanto, a diferenciação hematopoiética natural no saco vitelínico é limitada aos eritrócitos primários que retêm núcleos e sintetizam hemoglobina fetal. No entanto, acreditava-se tradicionalmente que o saco vitelínico serve como a única fonte de HSCs migrando para os órgãos hematopoiéticos do embrião em desenvolvimento e fornecendo hematopoiese definitiva em animais adultos, uma vez que o aparecimento de HSCs no corpo do embrião coincide com o fechamento dos sistemas vasculares do saco vitelínico e do embrião. Este ponto de vista é apoiado por dados de que as células do saco vitelínico, quando clonadas in vitro, dão origem a granulócitos e macrófagos, e in vivo - a colônias esplênicas. Posteriormente, no decorrer de experimentos de transplante, estabeleceu-se que as células hematopoiéticas do saco vitelínico, que no próprio saco vitelínico são capazes de se diferenciar apenas em eritrócitos primários, no microambiente do fígado de camundongos SCID recém-nascidos e adultos, o timo depletado ou alimentador estromal adquirem a capacidade de repovoar órgãos hematopoiéticos com a restauração de todas as linhagens hematopoiéticas, mesmo em animais receptores adultos. Em princípio, isso nos permite classificá-las como verdadeiras HSCs - como células que funcionam no período pós-natal. Supõe-se que o saco vitelínico, juntamente com a região AGM, sirva como fonte de HSCs para a hematopoiese definitiva em mamíferos, mas sua contribuição para o desenvolvimento do sistema hematopoiético ainda não está clara. O significado biológico da existência de dois órgãos hematopoiéticos com funções semelhantes na embriogênese mamária inicial também não está claro.

A busca por respostas a essas perguntas continua. In vivo, foi possível comprovar a presença, no saco vitelínico de embriões de 8 a 8,5 dias de idade, de células que restauram a linfopoiese em camundongos SCID irradiados subletalmente com deficiência pronunciada de linfócitos T e B. Células hematopoiéticas do saco vitelínico foram injetadas tanto intraperitonealmente quanto diretamente no baço e no tecido hepático. Após 16 semanas, linfócitos T CD4+ e CD8+ TCR/CD34 e linfócitos B B-220+IgM+ marcados com os genes antrx do MHC do doador foram detectados nos receptores. Ao mesmo tempo, os autores não encontraram células-tronco capazes de tal restauração do sistema imunológico no corpo de embriões de 8 a 8,5 dias de idade.

As células hematopoiéticas do saco vitelínico apresentam alto potencial proliferativo e são capazes de autorreprodução prolongada in vitro. Alguns autores identificam essas células como CTHs com base na geração prolongada (quase 7 meses) de células progenitoras eritroides, que diferem das células progenitoras da medula óssea da linhagem eritroide por um período de passagem mais longo, colônias maiores, maior sensibilidade a fatores de crescimento e proliferação mais prolongada. Além disso, em condições adequadas de cultivo de células do saco vitelínico in vitro, células progenitoras linfoides também são formadas.

Os dados apresentados geralmente nos permitem considerar o saco vitelínico como uma fonte de HSCs, menos comprometidas e, portanto, possuindo um maior potencial proliferativo do que as células-tronco da medula óssea. No entanto, apesar de o saco vitelínico conter células progenitoras hematopoiéticas pluripotentes que mantêm várias linhagens de diferenciação hematopoiética in vitro por um longo período, o único critério para a integralidade das HSCs é sua capacidade de repovoar a longo prazo os órgãos hematopoiéticos do receptor, cujas células hematopoiéticas são destruídas ou geneticamente defeituosas. Assim, a questão-chave é se as células hematopoiéticas pluripotentes do saco vitelínico podem migrar e povoar órgãos hematopoiéticos e se é aconselhável revisar os trabalhos conhecidos que demonstram sua capacidade de repovoar os órgãos hematopoiéticos de animais maduros com a formação das principais linhagens hematopoiéticas. Fontes intraembrionárias de GSCs definitivas foram identificadas em embriões de aves na década de 1970, o que já então lançava dúvidas sobre as ideias estabelecidas sobre a origem extraembrionária das GSCs, inclusive em representantes de outras classes de vertebrados. Nos últimos anos, surgiram publicações sobre a presença de áreas intraembrionárias semelhantes contendo GSCs em mamíferos e humanos.

Deve-se ressaltar mais uma vez que o conhecimento fundamental nesta área é extremamente importante para a prática do transplante celular, pois ajudará não apenas a determinar a fonte preferencial de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), mas também a estabelecer as características da interação de células hematopoiéticas primárias com um organismo geneticamente estranho. Sabe-se que a introdução de células-tronco hematopoiéticas de fígado fetal humano em um embrião de ovelha na fase de organogênese leva ao nascimento de animais quimeras, no sangue e na medula óssea dos quais 3 a 5% das células hematopoiéticas humanas são determinadas de forma estável. Ao mesmo tempo, as HSCs humanas não alteram seu cariótipo, mantendo uma alta taxa de proliferação e a capacidade de diferenciação. Além disso, as HSCs xenogênicas transplantadas não entram em conflito com o sistema imunológico e os fagócitos do organismo hospedeiro e não se transformam em células tumorais, o que formou a base para o desenvolvimento intensivo de métodos para correção intrauterina de patologia genética hereditária usando HSCs ou ESCs transfectadas com genes deficientes.

Mas em que fase da embriogênese é mais apropriado realizar tal correção? Pela primeira vez, células determinadas para hematopoiese aparecem em mamíferos imediatamente após a implantação (6º dia de gestação), quando os sinais morfológicos de diferenciação hematopoiética e órgãos hematopoiéticos presuntivos ainda estão ausentes. Nesta fase, células dispersas do embrião de camundongo são capazes de repovoar os órgãos hematopoiéticos de receptores irradiados com a formação de eritrócitos e linfócitos que diferem das células hospedeiras pelo tipo de hemoglobina ou glicerofosfato isomerase, respectivamente, bem como um marcador cromossômico adicional (Tb) das células do doador. Em mamíferos, como em aves, simultaneamente com o saco vitelínico, antes do fechamento do leito vascular comum, as células hematopoiéticas aparecem diretamente no corpo do embrião na esplancnopleura paraaórtica. Células hematopoiéticas do fenótipo AA4.1+ foram isoladas da região AGM e caracterizadas como células hematopoiéticas multipotentes que formam linfócitos T e B, granulócitos, megacariócitos e macrófagos. Fenotipicamente, essas células progenitoras multipotentes são muito próximas às células hematopoiéticas humanas (HSCs) da medula óssea de animais adultos (CD34+c-kit+). O número de células AA4.1+ multipotentes entre todas as células da região AGM é pequeno – elas representam no máximo 1/12 de sua composição.

No embrião humano, também foi identificada uma região intraembrionária contendo HSCs homólogas à região AGM de animais. Além disso, em humanos, mais de 80% das células multipotentes com alto potencial proliferativo estão contidas no corpo do embrião, embora tais células também estejam presentes no saco vitelínico. Uma análise detalhada de sua localização mostrou que centenas dessas células são coletadas em grupos compactos localizados próximos ao endotélio da parede ventral da aorta dorsal. Fenotipicamente, são células CD34CD45+Lin. Ao contrário, no saco vitelínico, bem como em outros órgãos hematopoiéticos do embrião (fígado, medula óssea), tais células são únicas.

Consequentemente, no embrião humano, a região AGM contém aglomerados de células hematopoiéticas intimamente associados ao endotélio ventral da aorta dorsal. Esse contato também é rastreado no nível imunoquímico – tanto as células dos aglomerados hematopoiéticos quanto as células endoteliais expressam o fator de crescimento endotelial vascular, o ligante Flt-3, seus receptores FLK-1 e STK-1, bem como o fator de transcrição das células-tronco da leucemia. Na região AGM, os derivados mesenquimais são representados por uma densa cadeia de células arredondadas localizadas ao longo de toda a aorta dorsal e expressando tenascina C – uma glicoproteína da substância fundamental ativamente envolvida nos processos de interação e migração intercelular.

Células-tronco multipotentes da região AGM após transplante restauram rapidamente a hematopoiese em camundongos maduros irradiados e proporcionam hematopoiese eficaz por um longo período (até 8 meses). Os autores não encontraram células com tais propriedades no saco vitelínico. Os resultados deste estudo são confirmados pelos dados de outro trabalho, que mostrou que, em embriões em estágios iniciais de desenvolvimento (10,5 dias), a região AGM é a única fonte de células que correspondem à definição de HSC, restaurando a hematopoiese mieloide e linfoide em receptores maduros irradiados.

A linhagem estromal AGM-S3 foi isolada da região AGM, cujas células suportam a geração de células progenitoras comprometidas (CFU-GM, BFU-E, CFU-E e unidades formadoras de colônias de tipo misto) em cultura. O conteúdo destas últimas, durante o cultivo em uma subcamada alimentadora de células da linhagem AGM-S3, aumenta de 10 a 80 vezes. Assim, o microambiente da região AGM contém células-base estromais que suportam efetivamente a hematopoiese, de modo que a própria região AGM pode atuar como um órgão hematopoiético embrionário – uma fonte de HSCs definitivas, ou seja, HSCs que formam o tecido hematopoiético de um animal adulto.

A imunofenotipagem estendida da composição celular da região AGM mostrou que ela contém não apenas células hematopoiéticas multipotentes, mas também células comprometidas com a diferenciação mieloide e linfoide (linfócitos T e B). No entanto, a análise molecular de células CD34+c-kit+ individuais da região AGM usando a reação em cadeia da polimerase revelou ativação apenas dos genes beta-globina e mieloperoxidase, mas não dos genes linfoides que codificam a síntese de CD34, Thy-1 e 15. A ativação parcial de genes específicos da linhagem é característica dos estágios ontogenéticos iniciais da geração de HSCs e células progenitoras. Considerando que o número de células progenitoras comprometidas na região AGM de um embrião de 10 dias é 2 a 3 ordens de magnitude menor do que no fígado, pode-se argumentar que, no 10º dia da embriogênese, a hematopoiese na região AGM está apenas começando, enquanto no principal órgão hematopoiético do feto, durante esse período, as linhagens hematopoiéticas já se desenvolveram.

De fato, diferentemente das células-tronco hematopoiéticas iniciais (9 a 11 dias) do saco vitelínico e da região AGM, que repovoam o microambiente hematopoiético do recém-nascido, mas não do organismo adulto, as células progenitoras hematopoiéticas do fígado embrionário de 12 a 17 dias não necessitam mais de um microambiente pós-natal precoce e povoam os órgãos hematopoiéticos de um animal adulto em condições não piores do que as de um recém-nascido. Após o transplante de células-tronco hematopoiéticas hepáticas embrionárias, a hematopoiese em camundongos receptores adultos irradiados apresentou caráter policlonal. Além disso, utilizando colônias marcadas, demonstrou-se que o funcionamento dos clones enxertados está completamente sujeito à sucessão clonal revelada na medula óssea adulta. Consequentemente, HSCs de fígado embrionário, marcadas sob as condições mais suaves, sem pré-estimulação com citocinas exógenas, já possuem os principais atributos de HSCs adultas: elas não requerem um microambiente pós-embrionário precoce, entram em um estado de dormência profunda após o transplante e são mobilizadas para a formação clonal sequencialmente de acordo com o modelo de sucessão clonal.

Obviamente, é necessário abordar o fenômeno da sucessão clonal com mais detalhes. A eritropoiese é realizada por células-tronco hematopoiéticas que têm alto potencial proliferativo e a capacidade de se diferenciar em todas as linhagens de células precursoras comprometidas de células sanguíneas. Na intensidade normal da hematopoiese, a maioria das células-tronco hematopoiéticas está em estado dormente e é mobilizada para proliferação e diferenciação, formando sequencialmente clones que se substituem. Esse processo é chamado de sucessão clonal. Evidências experimentais de sucessão clonal no sistema hematopoiético foram obtidas em estudos com HSCs marcadas por transferência gênica retroviral. Em animais adultos, a hematopoiese é mantida por muitos clones hematopoiéticos funcionando simultaneamente, derivados de HSCs. Com base no fenômeno da sucessão clonal, foi desenvolvida uma abordagem de repopulação para a identificação de HSCs. De acordo com esse princípio, é feita uma distinção entre células-tronco hematopoiéticas de longo prazo (LT-HSC), que são capazes de restaurar o sistema hematopoiético ao longo da vida, e HSC de curto prazo, que desempenham essa função por um período de tempo limitado.

Se considerarmos as células-tronco hematopoiéticas do ponto de vista da abordagem de repovoamento, a peculiaridade das células hematopoiéticas do fígado embrionário é sua capacidade de criar colônias significativamente maiores em tamanho do que aquelas no crescimento de HSCs do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea, e isso se aplica a todos os tipos de colônias. Esse fato por si só indica um maior potencial proliferativo das células hematopoiéticas do fígado embrionário. Uma propriedade única das células progenitoras hematopoiéticas do fígado embrionário é um ciclo celular mais curto em comparação com outras fontes, o que é de grande importância do ponto de vista da eficácia do repovoamento de órgãos hematopoiéticos durante o transplante. A análise da composição celular da suspensão hematopoiética obtida de fontes de um organismo maduro indica que, em todos os estágios da ontogênese, as células nucleares são predominantemente representadas por células finalmente diferenciadas, cujo número e fenótipo dependem da idade ontogenética do doador de tecido hematopoiético. Em particular, suspensões de células mononucleares da medula óssea e do sangue do cordão umbilical consistem em mais de 50% de células maduras da série linfoide, enquanto o tecido hematopoiético do fígado embrionário contém menos de 10% de linfócitos. Além disso, as células da linhagem mieloide no fígado embrionário e fetal são representadas principalmente pela série eritroide, enquanto no sangue do cordão umbilical e na medula óssea predominam os elementos granulócitos-macrófagos.

Também é importante que o fígado embrionário contenha um conjunto completo dos precursores hematopoiéticos mais precoces. Entre estes últimos, destacam-se as células eritroides, granulopoiéticas, megacariopoiéticas e as células formadoras de colônias multilinhagens. Seus precursores mais primitivos – LTC-IC – são capazes de proliferar e se diferenciar in vitro por 5 semanas ou mais, e também mantêm atividade funcional após o enxerto no corpo do receptor durante transplantes alogênicos e até xenogênicos em animais imunodeficientes.

A conveniência biológica da predominância de células eritroides no fígado embrionário (até 90% do número total de elementos hematopoiéticos) deve-se à necessidade de suprir o volume sanguíneo rapidamente crescente do feto em desenvolvimento com massa eritrocitária. No fígado embrionário, a eritropoiese é representada por precursores eritroides nucleares com graus variados de maturidade, contendo hemoglobina fetal (α2u7), que, devido à sua maior afinidade pelo oxigênio, garante a absorção eficaz deste último do sangue materno. A intensificação da eritropoiese no fígado embrionário está associada a um aumento local na síntese de eritropoietina (EPO). Vale ressaltar que a presença de eritropoietina por si só é suficiente para a realização do potencial hematopoiético das células hematopoiéticas no fígado embrionário, enquanto uma combinação de citocinas e fatores de crescimento, consistindo de EPO, SCF, GM-CSF e IL-3, é necessária para o comprometimento das HSCs da medula óssea e do sangue do cordão umbilical com a eritropoiese. Ao mesmo tempo, células progenitoras hematopoiéticas precoces isoladas do fígado embrionário, que não possuem receptores para EPO, não respondem à eritropoietina exógena. Para a indução da eritropoietina em uma suspensão de células mononucleares do fígado embrionário, é necessária a presença de células mais avançadas sensíveis à eritropoietina com o fenótipo CD34+CD38+, que expressam o receptor de EPO.

Na literatura, ainda não há consenso sobre o desenvolvimento da hematopoiese no período embrionário. O significado funcional da existência de fontes extra e intraembrionárias de células progenitoras hematopoiéticas não foi estabelecido. No entanto, não há dúvida de que, na embriogênese humana, o fígado é o órgão central da hematopoiese e, entre a 6ª e a 12ª semana de gestação, serve como a principal fonte de células-tronco hematopoiéticas que povoam o baço, o timo e a medula óssea. Os GDRs garantem o desempenho das funções correspondentes nos períodos pré e pós-natal do desenvolvimento.

Vale ressaltar mais uma vez que o fígado embrionário, em comparação com outras fontes, é caracterizado pelo maior teor de células-tronco hematopoiéticas (CTHs). Aproximadamente 30% das células CD344 do fígado embrionário apresentam o fenótipo CD38. Ao mesmo tempo, o número de células progenitoras linfoides (CD45+) nos estágios iniciais da hematopoiese no fígado não ultrapassa 4%. Foi estabelecido que, à medida que o feto se desenvolve, da 7ª à 17ª semana de gestação, o número de linfócitos B aumenta progressivamente com um "degrau" mensal de 1,1%, enquanto o nível de CTHs diminui permanentemente.

A atividade funcional das células-tronco hematopoiéticas também depende do período de desenvolvimento embrionário de sua fonte. O estudo da atividade de formação de colônias de células hepáticas de embriões humanos com 6-8 e 9-12 semanas de gestação durante o cultivo em meio semilíquido na presença de SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 e EPO mostrou que o número total de colônias é 1,5 vezes maior quando semeadas HSCs de fígado embrionário em estágios iniciais de desenvolvimento. Ao mesmo tempo, o número de células progenitoras de mielopoiese, como CFU-GEMM, no fígado com 6-8 semanas de embriogênese é mais de três vezes maior do que seu número com 9-12 semanas de gestação. Em geral, a atividade de formação de colônias de células hepáticas hematopoiéticas de embriões no primeiro trimestre de gestação foi significativamente maior do que a de células hepáticas fetais no segundo trimestre de gravidez.

Os dados acima indicam que o fígado embrionário no início da embriogênese se distingue não apenas por um maior conteúdo de células progenitoras hematopoiéticas precoces, mas também por um espectro mais amplo de diferenciação em diversas linhagens celulares. Essas características da atividade funcional das células-tronco hematopoiéticas do fígado embrionário podem ter certa significância clínica, visto que suas características qualitativas nos permitem esperar um efeito terapêutico pronunciado mesmo com o transplante de um pequeno número de células obtidas em estágios iniciais da gestação.

No entanto, o problema da quantidade de células-tronco hematopoiéticas necessárias para um transplante eficaz permanece em aberto e relevante. Tentativas estão sendo feitas para solucioná-lo utilizando o alto potencial de autorreprodução de células hematopoiéticas do fígado embrionário in vitro quando estimuladas por citocinas e fatores de crescimento. Com a perfusão constante de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) hepáticas embrionárias precoces em um biorreator, após 2 a 3 dias, é possível obter uma quantidade de células-tronco hematopoiéticas na produção 15 vezes maior do que seu nível inicial. Para efeito de comparação, deve-se observar que são necessárias pelo menos duas semanas para atingir um aumento de 20 vezes na produção de CTHs do sangue do cordão umbilical humano nas mesmas condições.

Assim, o fígado embrionário difere de outras fontes de células-tronco hematopoiéticas por apresentar maior conteúdo de células progenitoras hematopoiéticas comprometidas e precoces. Em cultura com fatores de crescimento, as células hepáticas embrionárias com o fenótipo CD34+CD45Ra1 CD71l0W formam 30 vezes mais colônias do que células semelhantes do sangue do cordão umbilical e 90 vezes mais do que as células-tronco hematopoiéticas humanas (HSCs) da medula óssea. As diferenças mais pronunciadas entre as fontes especificadas estão no conteúdo de células progenitoras hematopoiéticas precoces, que formam colônias mistas – a quantidade de UFC-GEMM no fígado embrionário excede a do sangue do cordão umbilical e da medula óssea em 60 e 250 vezes, respectivamente.

Também é importante que, até a 18ª semana de desenvolvimento embrionário (período de início da hematopoiese na medula óssea), mais de 60% das células hepáticas estejam envolvidas na implementação da função hematopoiética. Como o feto humano não possui timo e, consequentemente, timócitos até a 13ª semana de desenvolvimento, o transplante de células hematopoiéticas do fígado embrionário de 6 a 12 semanas de gestação reduz significativamente o risco de desenvolver uma reação "enxerto versus hospedeiro" e não requer a seleção de um doador histocompatível, pois facilita relativamente a obtenção do quimerismo hematopoiético.