Diagnóstico laboratorial da tuberculose

A tuberculose é uma doença de fácil diagnóstico nas condições modernas e nos avanços científicos. O diagnóstico laboratorial da tuberculose ocupa um lugar central entre outros métodos diagnósticos, perdendo apenas para os métodos de exame de raios X.

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Exame de sangue clínico

Em pacientes com tuberculose, alterações no exame de sangue geral não são patognomônicas. Nas formas limitadas e pouco ativas da tuberculose, a hipocromia de eritrócitos com número normal é característica. Em infiltrados maciços ou pneumonia caseosa, com linfadenite caseosa disseminada, dano intestinal específico, bem como com grandes hemorragias pulmonares ou pós-operatórias, observam-se eritropenia e microcitose, oligocromasia e policromasia. Macrocitose e, especialmente, poiquilocitose, são encontradas com muito menos frequência, geralmente com anemia grave. O número de reticulócitos na fase compensada da tuberculose varia de 0,1 a 0,6%, na fase subcompensada - de 0,6 a 1,0%, e para a fase descompensada, 1% dos reticulócitos é característico.

Em alguns casos de tuberculose, pode ser observada leucocitose moderada (até 15 mil leucócitos), menos frequentemente leucopenia, que ocorre em 2-7% dos casos em pacientes com formas limitadas e leves do processo e em 12,5% na tuberculose pulmonar destrutiva e progressiva.

Na maioria das vezes, ocorrem alterações na fórmula leucocitária. Observa-se neutrofilia relativa e absoluta, com uma alteração moderada da fórmula leucocitária para a esquerda, em direção aos promielócitos. Os mielócitos são muito raramente encontrados em casos de tuberculose não complicada. Um aumento no número de neutrófilos com granularidade patológica no hemograma de um paciente com tuberculose sempre indica a duração do processo: em pacientes com tuberculose grave, quase todos os neutrófilos apresentam granularidade patológica. Quando um surto de tuberculose desaparece, a alteração nuclear retorna ao normal com relativa rapidez. A granularidade patológica dos neutrófilos geralmente persiste por mais tempo do que outras alterações no hemograma.

O conteúdo de eosinófilos no sangue periférico também flutua dependendo da fase do processo e do estado alérgico do organismo. Seu número diminui para aneosinofilia em surtos graves e prolongados da doença e, inversamente, aumenta durante a reabsorção de infiltrados e derrame pleural, bem como nas formas iniciais de tuberculose primária.

A maioria das formas de tuberculose primária é acompanhada de linfopenia, que às vezes persiste por vários anos, mesmo após a cicatrização de alterações específicas. A tuberculose secundária na fase aguda, dependendo da gravidade do processo, pode ser acompanhada por um número normal de linfócitos ou linfopenia.

Entre os testes para avaliar o processo da tuberculose, um lugar especial é ocupado pela determinação da velocidade de hemossedimentação (VHS), que é importante para avaliar o curso do processo da tuberculose e identificar suas formas ativas. Um aumento na VHS indica a presença de um processo patológico (infeccioso e inflamatório, purulento, séptico, hemoblastose, linfogranulomatose, etc.) e serve como um indicador de sua gravidade, mas valores normais de VHS nem sempre indicam a ausência de patologia. A aceleração da hemossedimentação é facilitada pelo aumento do conteúdo de globulinas, fibrinogênio, colesterol no sangue e pela diminuição da viscosidade sanguínea. A desaceleração da hemossedimentação é característica de condições acompanhadas de hemoconcentração, aumento do conteúdo de albuminas e ácidos biliares.

O hemograma de pacientes com tuberculose muda durante o tratamento. Quanto mais bem-sucedida a intervenção terapêutica, mais rapidamente as alterações hematológicas desaparecem. Ao mesmo tempo, deve-se considerar o efeito de diversos medicamentos antibacterianos na hematopoiese. Frequentemente, eles causam eosinofilia, em alguns casos, leucocitose e, mais frequentemente, leucopenia, até agranulocitose e reação linfoide-reticular. O monitoramento hematológico sistemático e a análise correta dos dados obtidos são essenciais para avaliar o estado clínico do paciente, a dinâmica do processo e a eficácia do tratamento.

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Análise clínica de urina

Em caso de tuberculose do trato urinário, a análise de urina é o principal método diagnóstico laboratorial. Podem ser observadas leucocitúria, eritrocitúria, proteinúria, hipoisostenúria, micobacteriúria tuberculosa e bacteriúria inespecífica.

A leucocitúria é o sintoma mais comum da tuberculose do trato urinário antes da quimioterapia específica e está ausente apenas em casos excepcionais, como a obliteração completa do lúmen do ureter. O teste de Nechiporenko (determinação do número de leucócitos em 1 ml de urina) ajuda a avaliar mais objetivamente o grau de leucocitúria na nefrotuberculose e, em alguns casos, detectá-la com um exame geral de urina normal. No entanto, deve-se levar em consideração que a leucocitúria pode ocorrer em pielonefrite aguda e crônica, cistite, uretrite, cálculos renais e ureterais.

A eritrocitúria, assim como a leucocitúria, é considerada um dos sinais laboratoriais mais comuns da tuberculose geniturinária. A frequência da hematúria depende da prevalência do processo; ela aumenta à medida que o processo tuberculoso destrutivo no rim se desenvolve. A eritrocitúria sem leucocitúria é mais típica dos estágios iniciais da tuberculose renal. A hematúria, prevalecendo sobre a leucocitúria, é um argumento importante a favor da tuberculose renal na diferenciação da pielonefrite inespecífica.

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Exame bioquímico de sangue

Na tuberculose, as alterações em alguns índices bioquímicos dependem principalmente da fase do processo, de complicações e de diversas doenças concomitantes. Em pacientes com tuberculose pulmonar e de outros órgãos inativa, as proteínas totais e as frações proteicas do soro sanguíneo não se alteram e determinam seu conteúdo normal.

Nas formas agudas da doença, bem como na exacerbação e progressão das formas crônicas da tuberculose, o coeficiente albumina-globulina diminui.

De grande importância na avaliação do estado funcional e dos danos orgânicos ao fígado na tuberculose e suas complicações é a determinação da bilirrubina direta e total, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) no soro sanguíneo. A determinação dinâmica dos níveis de aminotransferases e bilirrubina no tratamento de pacientes com tuberculose, especialmente em suas formas graves, é um componente obrigatório do exame bioquímico de pacientes com tuberculose e é realizada mensalmente.

A avaliação do estado funcional dos rins inclui a determinação da creatinina sérica e o cálculo da taxa de filtração glomerular usando a fórmula de Cockcroft-Gault. O cálculo da taxa de filtração glomerular usando o teste de Reberg fornece resultados menos precisos.

O principal objetivo dos estudos bioquímicos dinâmicos de pacientes com tuberculose é monitorar o curso do processo, a detecção oportuna dos efeitos colaterais dos medicamentos e a correção adequada dos distúrbios emergentes da homeostase.

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Aplicação de métodos de pesquisa bioquímica na tuberculose extrapulmonar

O indicador mais informativo é considerado o conteúdo de ácido tuberculosoestárico em fluidos biológicos, porém sua determinação está associada a dificuldades técnicas (necessidade de utilização de cromatografia gasosa e espectrometria de massas).

É promissor medir a atividade da adenosina desaminase, uma enzima determinada em fluidos: sinovial, pericárdico, ascítico ou cerebrospinal. Os principais produtores de adenosina desaminase são linfócitos e monócitos. A determinação da atividade da adenosina desaminase em fluidos biológicos facilita o diagnóstico de sinovite tuberculosa, tuberculose dos linfonodos, meningite tuberculosa e serosite tuberculosa.

Alguns indicadores bioquímicos, devido à sua inespecificidade, são determinados apenas em fluidos biológicos próximos à lesão. O nível dos indicadores é medido em resposta à administração subcutânea ou intradérmica de tuberculina (geralmente antes da administração e 48 e 72 horas após). Após isso, o grau de aumento no nível do marcador (em %) é calculado em relação ao nível inicial.

Idealmente, a atividade da enzima transamidinase específica do órgão é determinada na urina; seu aparecimento é observado em lesões renais de diversas origens. O estudo da transamidinase justifica-se apenas em condições de administração subcutânea de tuberculina para exacerbar o processo inflamatório local. A atividade da transamidinase é determinada na urina inicialmente e 24 a 72 horas após a administração de 50 TE de tuberculina. Um aumento de 2 vezes ou mais na fermentúria permite, em 82% dos casos, diferenciar a tuberculose renal ativa da exacerbação de pielonefrite crônica.

Em caso de tuberculose dos órgãos genitais femininos, as concentrações de haptoglobina e malondialdeído no sangue são determinadas sob as condições do teste provocativo da tuberculina. A tuberculina é administrada por via subcutânea na dose de 50 TE e um novo estudo bioquímico é realizado após 72 horas. Em caso de etiologia tuberculosa, o grau de aumento no nível de haptoglobina é de pelo menos 28% e o nível de malondialdeído é de 39% ou mais. A determinação da atividade da adenosina desaminase no fluido peritoneal obtido da bolsa de Douglas também é usada. A punção é examinada novamente 72 horas após a administração intradérmica de tuberculina nas doses de 0,1 TE e 0,01 TE na área de projeção dos órgãos genitais internos na parede abdominal anterior. Um aumento na atividade da adenosina desaminase em 10% ou mais em comparação com o valor inicial indica um processo tuberculoso.

Em caso de lesão ocular, examina-se a reação focal que ocorre no olho em resposta à estimulação antigênica. Nesse caso, o desenvolvimento de uma resposta acentuada acompanhada de diminuição da função visual é indesejável. Como a avaliação de reações focais mínimas costuma ser difícil, recomenda-se focar paralelamente no grau de aumento da haptoglobina ou da adenosina desaminase no soro sanguíneo para fundamentar a conclusão.

Todos os estudos bioquímicos devem ser realizados em combinação com outros métodos.

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Estudo do sistema de coagulação sanguínea

A relevância do estudo do estado do sistema de coagulação sanguínea em tisiologia se deve à presença de hemoptise ou hemorragias pulmonares em diversos pacientes com tuberculose pulmonar, bem como às complicações da hemocoagulação no tratamento cirúrgico da tuberculose. Além disso, a hemocoagulação intravascular latente naturalmente associada afeta o curso da doença e a eficácia da quimioterapia.

Em pacientes com tuberculose pulmonar com componente inflamatório predominantemente exsudativo, observa-se diminuição da atividade anticoagulante sanguínea. Em pacientes com baixa prevalência de lesão pulmonar específica com componente inflamatório predominantemente produtivo, a hemocoagulação intravascular é insignificante. Em pacientes com tuberculose pulmonar com hemoptise e hemorragias pulmonares, o estado do sistema de coagulação sanguínea é diferente: em pacientes com pequena perda sanguínea no auge da hemoptoica ou imediatamente após sua cessação, observa-se um aumento acentuado da capacidade de coagulação sanguínea devido à intensificação pronunciada dos processos de formação de trombina, mantendo-se a coagulabilidade "estrutural" aumentada. Em pacientes com perda sanguínea maciça, observa-se diminuição do potencial de coagulação devido à diminuição da concentração de fibrinogênio, da atividade do fator XIII e da contagem de plaquetas. Na fase de tratamento cirúrgico em pacientes com formas limitadas de tuberculose pulmonar, não ocorrem distúrbios significativos no sistema de homeostase. Em pacientes com processos generalizados, ao realizar pneumonectomia ou pleuropneumonectomia, frequentemente se desenvolve a síndrome DIC, que pode assumir a forma de uma “segunda doença”.

Para monitorar o estado do sistema de coagulação sanguínea em pacientes com tuberculose pulmonar, é necessário determinar o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), fibrinogênio, tempo de trombina, índice de protrombina, bem como tempo de sangramento e tempo de coagulação sanguínea.

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Estudos hormonais

Observações experimentais e clínicas modernas indicam a presença de alterações no estado hormonal em casos específicos de tuberculose pulmonar. Foi comprovado que a correção da disfunção dos sistemas pituitário-adrenal, pituitário-tireoideano e da função pancreática, em combinação com a terapia antituberculosa, contribui para a ativação da fibrogênese e dos processos de reparação no foco da inflamação específica.

O estado funcional do sistema pituitário-tireoideo é avaliado pelo conteúdo de triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e hormônio tireoestimulante hipofisário (TSH) no soro sanguíneo _. Foi _estabelecido que o hipotireoidismo subclínico é detectado em 38-45% dos pacientes com tuberculose pulmonar, sendo mais frequentemente diagnosticado nas formas disseminada e fibrocavernosa do processo. Nessas formas, os níveis de T3 e T4 são mais acentuadamente reduzidos _, e _um desequilíbrio desses hormônios ocorre na forma de um aumento na _{relação T4/} T3.

A função do córtex adrenal é avaliada pelo nível sérico de cortisol, e a função endócrina do pâncreas é avaliada pela concentração de insulina imunorreativa. Na fase aguda de uma doença infecciosa, a necessidade de cortisol e insulina endógenos aumenta. A hiperinsulinemia também indica resistência à insulina dos tecidos corporais, o que é típico de qualquer processo inflamatório ativo, em particular um específico. A determinação da função glicocorticoide das glândulas suprarrenais na tuberculose pulmonar ativa nos permite detectar a presença de hipercorticismo na maioria dos pacientes. Concentrações normais de cortisol no sangue em um paciente com inflamação infecciosa no período agudo devem ser consideradas uma insuficiência relativa da função glicocorticoide do córtex adrenal, o que pode servir de base para a terapia de reposição com doses adequadas de glicocorticoides.

Quase um terço dos pacientes com tuberculose pulmonar apresentam níveis baixos de insulinemia, próximos ao limite inferior da normalidade, enquanto 13% a 20% apresentam hiperinsulinismo significativo. Tanto o hipo quanto o hiperinsulinismo relativo são fatores de alto risco para o desenvolvimento de distúrbios do metabolismo de carboidratos de gravidade variável. Essas alterações na atividade funcional das células B pancreáticas exigem monitoramento regular da glicemia em pacientes com tuberculose e prevenção oportuna do diabetes mellitus. Além disso, isso serve como justificativa adicional para a adequação do uso de doses fisiológicas de insulina na terapia complexa da tuberculose.

Em geral, a diminuição dos níveis do hormônio tireoidiano, seu desequilíbrio, hipercortisolemia e hiperinsulinismo são mais pronunciados em pacientes com curso grave do processo tuberculoso, com lesões pulmonares extensas e sintomas pronunciados de intoxicação tuberculosa.

Diagnóstico microbiológico da tuberculose

Os estudos microbiológicos são necessários para identificar pacientes com tuberculose, verificar o diagnóstico, monitorar e corrigir a quimioterapia, avaliar os resultados do tratamento, ou seja, desde o momento em que um paciente com tuberculose é registrado até seu cancelamento.

Todos os programas e projetos epidemiológicos baseiam-se na avaliação do número de excretores de bactérias, o que é impossível sem o uso de métodos laboratoriais para a detecção de micobactérias da tuberculose. Ao examinar a atratividade da chamada população não organizada, a porcentagem de excretores de bactérias atinge 70 ou mais, o que torna os métodos laboratoriais um meio bastante eficaz para identificar pacientes com tuberculose nesse grupo populacional.

Os métodos microbiológicos tradicionais para o diagnóstico da tuberculose são estudos bacterioscópicos e culturais. Os métodos modernos incluem o cultivo de micobactérias tuberculosas em sistemas automatizados e PCR. No entanto, todos esses métodos são necessariamente combinados com métodos bacteriológicos clássicos.

Coleta de material diagnóstico

A eficácia dos testes laboratoriais depende em grande parte da qualidade do material diagnóstico. O cumprimento das normas de coleta, armazenamento e transporte de material diagnóstico e a implementação precisa do algoritmo de exame do paciente afetam diretamente o resultado e garantem a segurança biológica.

Uma variedade de materiais é utilizada para testar a tuberculose. Como a tuberculose pulmonar é a forma mais comum de infecção tuberculosa, os principais materiais para teste são considerados escarro e outros tipos de secreção da árvore traqueobrônquica: secreção do trato respiratório superior obtida após inalação de aerossóis; águas de lavagem brônquica; lavados broncoalveolares; material obtido durante broncoscopia, biópsia transtraqueal e intrapulmonar: aspirado brônquico, esfregaços laríngeos, exsudatos, esfregaços de feridas, etc.

A eficácia da pesquisa aumenta se for realizada a coleta controlada de material do paciente. Para isso, é alocada uma sala especialmente equipada ou adquiridas cabines especiais. A coleta de material é um procedimento perigoso, portanto, o material para pesquisa deve ser coletado em conformidade com as normas de segurança contra infecções.

O material para teste de Mycobacterium tuberculosis é coletado em frascos estéreis com tampas bem rosqueadas para evitar contaminação do ambiente e proteger o material coletado de contaminação.

Os frascos para coleta de material diagnóstico devem atender aos seguintes requisitos:

• deve ser feito de material resistente a impactos;
• deve derreter facilmente quando autoclavado;
• ter volume suficiente (40-50 ml):
• ter uma abertura ampla para coleta de escarro (diâmetro não inferior a 30 mm);
• ser fácil de manusear, transparente ou translúcido, para que a quantidade e a qualidade da amostra coletada possam ser avaliadas sem abrir a tampa.

Para obter resultados de pesquisa ideais, as seguintes condições devem ser atendidas:

• a coleta do material deve ser realizada antes do início da quimioterapia;
• o material para o estudo deve ser coletado antes das refeições ou da ingestão de medicamentos pela manhã;
• Para o estudo, é aconselhável coletar pelo menos 3 amostras de escarro matinais. O escarro é coletado durante 3 dias consecutivos;
• O material coletado deve ser entregue ao laboratório o mais rápido possível:
• nos casos em que for impossível entregar o material ao laboratório imediatamente, este será armazenado em geladeira com temperatura ambiente de 4 °C por no máximo 48 horas;
• No transporte do material é necessário ter atenção especial à integridade das garrafas.

O escarro coletado corretamente apresenta caráter mucoso ou mucopurulento. O volume ideal da porção examinada do escarro é de 3 a 5 ml.

A coleta de escarro é realizada sob a supervisão de um profissional de saúde. Os responsáveis pela coleta de escarro devem garantir o cumprimento de certas regras:

• É necessário explicar ao paciente o objetivo do exame e a necessidade de tossir não saliva ou muco nasofaríngeo, mas o conteúdo das partes profundas do trato respiratório. Isso pode ser alcançado por meio de uma tosse produtiva que ocorre após várias (2 a 3) respirações profundas. Também é necessário alertar o paciente de que ele deve primeiro enxaguar a boca com água fervida para remover a maior parte da microflora vegetante na cavidade oral e os restos alimentares que dificultam o exame do escarro.
• O profissional de saúde envolvido na coleta de escarro, além de avental e touca, deve usar máscara, luvas de borracha e avental de borracha;
• em pé atrás do paciente, é aconselhável que ele segure o frasco o mais próximo possível dos lábios e imediatamente separe o escarro nele ao tossir, enquanto é necessário garantir que o fluxo de ar seja direcionado para longe do profissional de saúde:
• Após a coleta do escarro, o profissional de saúde deve fechar cuidadosamente o frasco com a tampa e avaliar a quantidade e a qualidade do escarro coletado. O frasco é então etiquetado e colocado em uma caixa especial para transporte ao laboratório.

Caso o paciente não produza escarro, na noite anterior e no início da manhã do dia da coleta do material, deve-se administrar um expectorante: extrato de raiz de malva-rosa (mucaltina), bromexina, ambroxol, etc., ou então fazer uma inalação irritante, utilizando o equipamento instalado na sala de coleta de escarro. O material coletado dessa forma não está sujeito a preservação e deve ser examinado no dia da coleta. Para evitar sua "rejeição" no laboratório, deve-se fazer uma anotação especial no encaminhamento.

Caso não sejam realizados estudos microbiológicos em uma determinada instituição, o material diagnóstico coletado deve ser entregue ao laboratório centralmente, desde que seja mantido refrigerado ou com conservantes entre as entregas. O material é entregue ao laboratório em caixas de transporte que podem ser facilmente desinfetadas. Cada amostra deve ser etiquetada apropriadamente e todo o lote deve ter um formulário de acompanhamento preenchido.

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Modos e frequência de exame de pacientes

Durante o exame inicial, chamado de diagnóstico, de um paciente com tuberculose, é necessário examinar pelo menos 3 porções de escarro coletadas sob a supervisão de pessoal médico ao longo de 2 ou 3 dias, o que aumenta a eficácia da microscopia.

A triagem primária para tuberculose deve ser realizada por todas as instituições médicas e de diagnóstico do sistema de saúde. Recentemente, para aumentar a eficácia do exame primário, os chamados centros de microscopia foram organizados com base em laboratórios de diagnóstico clínico, equipados com microscópios e equipamentos modernos para garantir a segurança em caso de epidemias.

As instituições de combate à tuberculose utilizam um esquema de exames que prevê, no mínimo, três exames de escarro ou outro material diagnóstico em um período de três dias. Durante o tratamento, os exames microbiológicos são realizados regularmente, pelo menos uma vez por mês, na fase de quimioterapia intensiva. Ao passar para a fase de acompanhamento, os exames são realizados com menor frequência, em intervalos de dois a três meses, enquanto a frequência dos exames é reduzida para dois.

Características da coleta de material diagnóstico para tuberculose extrapulmonar

Uma característica do material patológico nas formas extrapulmonares de tuberculose é a baixa concentração de Mycobacterium tuberculosis nele, o que requer métodos mais sensíveis de pesquisa microbiológica, principalmente métodos de semeadura em meio nutriente.

Em caso de tuberculose geniturinária, a urina é o material mais acessível para exame. A coleta de urina deve ser realizada por um enfermeiro especialmente treinado.

Os órgãos genitais externos são lavados com água e sabão ou com uma solução fraca de permanganato de potássio. A abertura externa da uretra é cuidadosamente tratada. A porção média da urina matinal é coletada em um frasco estéril: nos homens - naturalmente, nas mulheres - por meio de um cateter. A urina da pelve renal é coletada em tubos de ensaio estéreis durante a cateterização de um ou dois rins, neste último caso - necessariamente separadamente de cada rim. Uma pequena quantidade dessa urina é centrifugada e o sedimento é examinado.

Nos homens, o esperma, as punções testiculares e as secreções da próstata são centrifugados para obter um sedimento. Em qualquer localização de um processo específico na área genital masculina, a massagem da próstata pode promover a liberação de secreções contendo micobactérias da tuberculose.

O sangue menstrual é coletado das mulheres por sucção ou com o uso de uma touca de Kafka. O material resultante é liberado dos eritrócitos por meio de lavagem com água destilada e centrifugação. O sedimento é examinado.

A secreção do canal cervical do útero é coletada em algum recipiente ou tampa de Kafka, ou seja, é desejável acumular 1-2 ml de material patológico.

O material obtido durante intervenções cirúrgicas nos rins, genitais, biópsias e raspados endometriais é homogeneizado. Para isso, é colocado em um almofariz estéril e cuidadosamente triturado com tesouras estéreis. Areia de rio estéril é adicionada à suspensão resultante em uma quantidade igual à sua massa, em seguida, 0,5-1,0 ml de solução isotônica de cloreto de sódio é adicionado e tudo é triturado até formar uma massa pastosa com a adição de solução isotônica de cloreto de sódio (4-5 ml). Em seguida, a massa é deixada em repouso por 1-1,5 minutos e o sobrenadante é examinado.

Tuberculose de ossos e articulações. A punção (pus de abscessos) obtida com uma seringa estéril é colocada em um recipiente estéril e imediatamente entregue ao laboratório. Utilizando uma pipeta estéril, previamente umedecida com solução isotônica estéril de cloreto de sódio, 2 a 5 ml de pus são coletados, transferidos para um frasco com esferas e adicionados mais 2 a 3 ml de solução isotônica de cloreto de sódio. O frasco é fechado com uma rolha e agitado em um agitador por 8 a 10 minutos. A suspensão homogeneizada é examinada.

Nas formas fistulosas da tuberculose osteoarticular, o pus é retirado da fístula. A secreção abundante é coletada diretamente em um tubo de ensaio. Em casos de secreção purulenta escassa, o trajeto da fístula é lavado com solução isotônica estéril de cloreto de sódio, e as lavagens coletadas em um tubo de ensaio ou em um pedaço de tampão embebido em pus são enviadas para exame.

O material cirúrgico obtido durante intervenções cirúrgicas em ossos e articulações pode consistir em massas purulento-necróticas, granulações, tecido cicatricial, tecido ósseo, tecido da membrana sinovial e outros substratos. Seu processamento é realizado como no caso da tuberculose renal.

O exame microbiológico do líquido sinovial em solução de citrato de sódio a 3% (na proporção de 1:1) para evitar coagulação é realizado imediatamente após a punção.

Tuberculose dos linfonodos. O pus extraído durante a punção dos linfonodos é examinado da mesma forma que o pus de abscessos. O tecido linfonodal obtido durante intervenções cirúrgicas e biópsias é examinado como em outras formas de tuberculose.

O estudo de fezes para Mycobacterium tuberculosis é realizado extremamente raramente devido à quase completa ausência de resultados positivos.

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Microscopia de micobactérias

A microscopia de escarro é um método relativamente rápido, simples e barato que deve ser utilizado em todos os casos de suspeita de tuberculose. Além disso, este estudo é realizado para avaliar a eficácia da quimioterapia e confirmar a recuperação ou a falha do tratamento na ausência de resultados de cultura.

São utilizados dois métodos de exame microscópico:

• método de microscopia direta, quando um esfregaço é preparado diretamente do material diagnóstico;
• um método de microscopia de sedimento preparado a partir de material tratado com descontaminantes para pesquisa cultural.

O primeiro método é utilizado nos laboratórios onde são realizados apenas estudos microscópicos (laboratórios de diagnóstico clínico da rede médica geral).

Os melhores resultados do exame microscópico são obtidos pela concentração do material diagnóstico (por exemplo, por centrifugação).

Para detectar Mycobacterium tuberculosis com 50% de probabilidade por microscopia, 1 ml de escarro deve conter mais de 5.000 células microbianas. O escarro de pacientes com formas pulmonares de tuberculose geralmente contém um número significativo de bactérias álcool-ácido resistentes, o que permite sua detecção confiável por bacterioscopia. A sensibilidade diagnóstica desse método pode ser aumentada examinando-se várias amostras de escarro de um paciente. Um resultado negativo no exame bacterioscópico não exclui o diagnóstico de tuberculose, visto que o escarro de alguns pacientes contém menos Mycobacterium do que o detectado por microscopia. A preparação inadequada dos esfregaços de escarro também pode ser a causa de um resultado negativo no exame bacterioscópico.

O método mais comum para detectar micobactérias álcool-ácido resistentes em um esfregaço é a coloração de Ziehl-Neelsen. O método baseia-se na penetração de carbolfucsina em uma célula microbiana através de uma membrana que inclui uma camada cerosa-lipídica, com o efeito simultâneo de aquecimento e a forte ação de ataque do fenol. A descoloração subsequente do esfregaço com uma solução de ácido sulfúrico a 25% ou álcool clorídrico a 3% leva à descoloração de todas as estruturas não álcool-ácido resistentes. Os elementos descoloridos do esfregaço são corados com uma solução de azul de metileno a 0,3%. As micobactérias não percebem os corantes de anilina convencionais, o que faz com que as micobactérias álcool-ácido resistentes sejam coradas em vermelho-framboesa, enquanto outros microrganismos e elementos celulares sejam corados em azul.

Para examinar esfregaços corados de acordo com Ziehl-Neelsen, utilize um microscópio binocular óptico com objetiva de imersão (aumento de 90 ou 100 vezes) e uma ocular com aumento de 7 ou 10 vezes. São examinados 100 campos de visão, o que é suficiente para detectar uma única micobactéria no esfregaço. Se o resultado desse exame for negativo, recomenda-se examinar outros 200 campos de visão para confirmação. Os resultados são registrados, indicando o número de micobactérias álcool-ácido resistentes (BAAR) detectadas.

Além deste método, a coloração com fluorocromo é utilizada para microscopia luminescente, o que permite obter os melhores resultados. O uso deste método aumenta a eficiência da microscopia em 10-15%. Quando as micobactérias são tratadas com corantes luminescentes (auramina, rodamina, etc.), estas substâncias também se ligam às estruturas cerosas da célula microbiana. Quando as células coradas são irradiadas com uma fonte de luz excitante (um determinado espectro de radiação ultravioleta), elas começam a brilhar em laranja ou vermelho vivo contra um fundo preto ou verde escuro. Devido ao alto brilho e contraste da imagem visível, a ampliação geral do microscópio pode ser reduzida em 4-10 vezes, o que expande o campo de visão e reduz o tempo de visualização da preparação. Junto com isso, devido à profundidade de campo significativamente maior, o conforto do estudo pode ser aumentado.

Ao utilizar a microscopia de fluorescência, a visualização da mesma área de um esfregaço leva significativamente menos tempo do que a microscopia óptica de esfregaços corados de acordo com Ziehl-Neelsen. Se um microscopista visualiza aproximadamente 20 a 25 desses esfregaços durante um dia de trabalho, com o auxílio da microscopia de fluorescência ele pode examinar mais de 60 a 80 amostras simultaneamente. Microscopistas experientes sabem que a coloração de células com uma mistura de auramina e rodamina é, de certa forma, específica para micobactérias álcool-ácido resistentes, que, neste caso, apresentam a aparência de bastonetes dourados. As saprófitas apresentam coloração esverdeada.

Outra vantagem importante do método de microscopia de fluorescência é a capacidade de detectar micobactérias alteradas que perderam suas propriedades de resistência a ácidos sob a influência de uma série de fatores desfavoráveis, em particular quimioterapia intensiva, e, portanto, não são detectadas pela coloração de Ziehl-Neelsen.

As desvantagens do método de microscopia de fluorescência incluem o custo relativamente alto do microscópio e de sua operação. No entanto, em laboratórios centralizados ou outros grandes laboratórios, onde a carga de trabalho excede a média de três técnicos de laboratório trabalhando com três microscópios convencionais, é mais barato usar um microscópio de fluorescência.

Os métodos bacterioscópicos apresentam uma especificidade bastante alta (89-100%). Cerca de 97% dos resultados positivos obtidos por qualquer método microscópico são claramente confirmados pelos resultados da semeadura.

Deve-se notar que o exame microscópico de um esfregaço de material patológico não permite determinar a espécie de micobactéria ácido-resistente detectada. O método microscópico permite concluir apenas sobre a presença ou ausência de microrganismos ácido-resistentes na preparação, o que se explica pela existência na natureza de um grande número de microrganismos ácido-resistentes não tuberculosos, morfologicamente semelhantes às micobactérias do complexo da tuberculose.

A avaliação dos resultados da microscopia é realizada em unidades semiquantitativas.

Para poder comparar os resultados de diferentes métodos de microscopia, são introduzidos coeficientes empíricos. Por exemplo, para comparar os resultados de um esfregaço corado com corantes fluorescentes com os dados de um estudo de microscopia óptica (aumento de 1000 vezes), é necessário dividir o número de micobactérias álcool-ácido resistentes detectadas usando um microscópio de fluorescência pelo coeficiente correspondente: com aumento de 250 vezes do microscópio - por 10, com aumento de 450 vezes - por 4, com aumento de 630 vezes - por 2.

Características da microscopia na tuberculose extrapulmonar

A microscopia direta é realizada, assim como a microscopia de esfregaços preparados após enriquecimento com posterior coloração por Ziehl-Neelsen ou corantes fluorescentes. A microscopia direta de esfregaços é ineficaz devido à baixa concentração de micobactérias no material, sendo, portanto, mais racional o uso de métodos de enriquecimento. A centrifugação é o método mais eficaz. Se o material biológico for viscoso, utiliza-se a centrifugação com homogeneização e liquefação simultâneas do material, realizada em centrífugas de alta velocidade com força de centrifugação de 3000 g e soluções de hipoclorito. Outros métodos de enriquecimento, como a microflotação, não são utilizados atualmente devido à formação de aerossóis biologicamente perigosos.

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Método de cultura para diagnóstico de tuberculose

O método de semeadura, ou método de cultura, é mais sensível que a baciloscopia e apresenta diversas vantagens. Permite a detecção de várias dezenas de micobactérias viáveis no material examinado e possui alto valor diagnóstico. Isso é especialmente importante ao examinar material de pacientes recém-diagnosticados ou tratados que excretam um pequeno número de micobactérias.

Comparada à microscopia, a pesquisa em cultura permite aumentar o número de pacientes com tuberculose detectados em mais de 15% a 25%, bem como verificar a tuberculose em estágios iniciais, quando a doença ainda é facilmente tratável. Uma vantagem muito importante da pesquisa em cultura é a possibilidade de obter uma cultura do patógeno, que pode ser identificada e estudada em relação à sensibilidade aos medicamentos, virulência e outras propriedades biológicas.

As desvantagens dos métodos de cultivo incluem sua duração (o período de espera pelos materiais chega a 10 semanas), maior custo e a complexidade do processamento do material de diagnóstico.

Princípios do tratamento pré-semeadura de material diagnóstico

Métodos microbiológicos convencionais não podem ser utilizados para a realização de testes de tuberculose. Isso se deve ao fato de que as micobactérias da tuberculose crescem muito lentamente e a maioria das amostras clínicas contém microrganismos e fungos piogênicos e putrefativos de crescimento rápido. Seu rápido crescimento em meios ricos em nutrientes interfere no desenvolvimento das micobactérias e não permite o isolamento do patógeno da tuberculose, portanto, o material diagnóstico deve ser pré-tratado antes da semeadura. Além disso, as micobactérias liberadas do trato respiratório do paciente geralmente são cercadas por uma grande quantidade de muco, o que dificulta sua concentração. Nesse sentido, antes da semeadura de escarro e outros materiais semelhantes, eles devem ser liquefeitos e descontaminados.

Todos os detergentes e descontaminantes têm um efeito tóxico mais ou menos pronunciado sobre as micobactérias. Como resultado do tratamento, até 90% das micobactérias podem morrer. Para preservar uma parcela suficiente da população micobacteriana, é necessário utilizar métodos de tratamento suaves que permitam, por um lado, suprimir microrganismos piogênicos e putrefativos de crescimento rápido e, por outro, preservar ao máximo a viabilidade das micobactérias presentes no material.

Dependendo do material, sua homogeneidade e nível de contaminação, vários descontaminantes são usados para o tratamento de pré-semeadura: para escarro - solução de hidróxido de sódio a 4%, soluções de fosfato trissódico a 10%, cloreto de benzalcônio fosfato trissódico, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteína-hidróxido de sódio) com uma concentração final de NaOH de 1%, para urina e outros materiais líquidos - solução de ácido sulfúrico a 3%, para amostras contaminadas, materiais contendo gordura - solução de ácido oxálico até 5%. Além disso, em alguns casos, enzimas e surfactantes (detergentes) são usados. O uso de Tween e alguns outros detergentes é acompanhado por menor morte de células micobacterianas (40-50% sobrevivem). No entanto, eles só podem ser usados para materiais líquidos. O NALC-NaOH, produzido em kits, é o mais amplamente utilizado no mundo. Este método permite isolar mais de 85% da população de células micobacterianas. A descontaminação de materiais sólidos contendo tecido é mais complexa, pois é difícil prever o grau de dispersão do material durante a homogeneização. Por exemplo, o processamento de biópsias de linfonodos é frequentemente acompanhado por um aumento na frequência de contaminação com flora estranha. Nesse caso, pode-se utilizar etônio a 1%.

O material não homogêneo é homogeneizado com esferas de vidro na presença de descontaminantes. Os materiais líquidos são pré-centrifugados e apenas o sedimento é processado.

Técnica de semeadura e incubação

Após o processamento preliminar, o material é centrifugado, o que precipita as micobactérias e aumenta seu conteúdo no sedimento ("enriquecimento do sedimento"). O sedimento resultante é neutralizado e inoculado na superfície de meios nutritivos densos ou tubos de ensaio com meio líquido (semilíquido). Esfregaços para exame microscópico são preparados a partir do sedimento restante. A técnica de semeadura deve evitar a contaminação cruzada do material diagnóstico.

Para uma interpretação clínica confiável dos resultados da pesquisa microbiológica, a seguinte regra deve ser observada: estudos microscópicos e culturais devem ser realizados paralelamente a partir da mesma amostra de material diagnóstico.

Os tubos inoculados são colocados em um termostato a 37 ^° C por 2 dias na posição horizontal. Isso garante uma absorção mais uniforme do material no meio nutriente. Após 2 dias, os tubos são movidos para a posição vertical e hermeticamente fechados com rolhas de borracha ou silicone para evitar que o meio semeado seque.

As culturas são mantidas em um termostato a 37 ^° C por 10 a 12 semanas, com inspeção semanal regular. Os seguintes parâmetros são registrados em cada inspeção de controle:

• período de crescimento visualmente observável a partir do dia da semeadura;
• taxa de crescimento (número de UFC);
• contaminação da cultura com flora microbiana estranha ou fungos (tais tubos de ensaio são removidos);
• Nenhum crescimento visível. Os tubos são deixados no termostato até a próxima inspeção.

Meios nutritivos

Diversos meios nutritivos são utilizados para o cultivo de micobactérias: sólidos, semilíquidos e líquidos. No entanto, nenhum dos meios nutritivos conhecidos possui propriedades que garantam o crescimento de todas as células micobacterianas. Nesse sentido, para aumentar a eficiência, recomenda-se o uso simultâneo de 2 a 3 meios nutritivos de diferentes composições.

Como meio padrão para o isolamento primário do patógeno da tuberculose e determinação de sua sensibilidade aos medicamentos, a OMS recomenda o meio Lowenstein-Jensen. Trata-se de um meio denso para ovos, no qual o crescimento de micobactérias é obtido do 20º ao 25º dia após a semeadura do material bacterioscopicamente positivo. A semeadura do material bacterioscopicamente negativo requer um período de incubação mais longo (até 10 a 12 semanas).

Em nosso país, o meio Finn-II para ovos, proposto por E.R. Finn, tornou-se amplamente difundido. Sua diferença reside no fato de que, em vez de L-asparagina, utiliza glutamato de sódio, que desencadeia outras vias para a síntese de aminoácidos em micobactérias. O crescimento ocorre neste meio um pouco mais cedo, e a frequência de isolamento de micobactérias é 6 a 8% maior do que no meio Lowenstein-Jensen.

Para aumentar a eficiência do diagnóstico bacteriológico da tuberculose extrapulmonar, recomenda-se a inclusão de meio Finn-II modificado no complexo de meios nutrientes. Para acelerar o crescimento, adiciona-se 0,05% de tioglicolato de sódio ao meio nutriente Finn-II, o que reduz a concentração de oxigênio. Para proteger os sistemas enzimáticos das micobactérias dos produtos tóxicos da peroxidação lipídica, o antioxidante acetato de α-tocoferol é introduzido no meio nutriente Finn-II na concentração de 0,001 μg/ml. O material diagnóstico é semeado utilizando o método padrão.

Em laboratórios antituberculose na Rússia, outras modificações de meios nutritivos densos também são usadas: o meio nutritivo "Novaya" proposto por GG Mordovsky, os meios nutritivos A-6 e A-9 desenvolvidos por VA Anikin, etc.

Devido ao fato de que durante a quimioterapia ocorrem danos em vários sistemas metabólicos da célula microbiana, parte da população micobacteriana perde a capacidade de se desenvolver normalmente em meios nutritivos convencionais e requer meios nutritivos osmoticamente equilibrados (semilíquidos ou líquidos).

Avaliação e registro dos resultados da cultura de material diagnóstico

Algumas cepas e tipos de micobactérias crescem lentamente, podendo ocorrer crescimento mesmo após 90 dias. O número dessas culturas é pequeno, mas isso obriga a manter as semeaduras em um termostato por 2,5 a 3 meses.

Culturas virulentas de Mycobacterium tuberculosis geralmente crescem em meios de cultura sólidos com ovos como colônias na forma R, de tamanho e aparência variados. As colônias são secas, enrugadas, de cor marfim e levemente pigmentadas. Em outros meios, as colônias de Mycobacterium tuberculosis podem ser mais úmidas. Após um ciclo de quimioterapia ou durante o tratamento, colônias lisas com crescimento úmido (formas S) podem ser isoladas.

Ao isolar culturas, um conjunto de estudos especiais é usado para distinguir micobactérias da tuberculose de micobactérias não tuberculosas e saprófitas álcool-ácido resistentes.

Uma resposta positiva é dada após um exame microscópico obrigatório de um esfregaço das colônias cultivadas coradas de acordo com Ziehl-Neelsen. No caso de crescimento de micobactérias, bastonetes vermelhos brilhantes são encontrados nos esfregaços, dispostos isoladamente ou em grupos, formando aglomerados em forma de feltro ou tranças. Em culturas jovens, especialmente aquelas isoladas de pacientes tratados com quimioterapia por um longo período, as micobactérias se distinguem por polimorfismo pronunciado, até a presença de variantes curtas, quase cocoides ou alongadas, semelhantes ao micélio fúngico, juntamente com formas em forma de bastonetes.

A intensidade do crescimento micobacteriano é determinada de acordo com o seguinte esquema: (+) - 1-20 UFC em tubo de ensaio (baixa excreção bacteriana); (++) - 20-100 UFC em tubo de ensaio (excreção bacteriana moderada); (+++) - >100 UFC em tubo de ensaio (excreção bacteriana abundante). No diagnóstico laboratorial da tuberculose, não basta apenas responder se as micobactérias foram ou não detectadas por um método específico. Também é necessário ter uma ideia detalhada do volume e da natureza da população micobacteriana, sua composição e propriedades. São esses dados que permitem interpretar corretamente o estado do processo, planejar táticas e ajustar prontamente o tratamento.

Nos últimos anos, meios nutritivos à base de ágar com diversos aditivos de crescimento e o uso de uma mistura gasosa especial têm sido propostos para acelerar o crescimento de micobactérias. Para promover o crescimento de micobactérias nesses meios, uma atmosfera com alto teor de dióxido de carbono (4-7%) é criada durante o cultivo. Para isso, são utilizadas incubadoras especiais de CO₂ _. No entanto, os sistemas automatizados de cultivo de micobactérias têm recebido o maior desenvolvimento: MGIT-BACTEC-960 e MB/Bact.

Um desses sistemas é o MGIT (Tubo Indicador de Crescimento de Micobactérias), um desenvolvimento de alta tecnologia projetado para o diagnóstico bacteriológico acelerado da tuberculose e a determinação da sensibilidade de micobactérias a medicamentos de primeira e algumas segunda linha. O MGIT foi projetado para uso como parte do dispositivo VASTEC-960. Os microrganismos são cultivados em tubos de ensaio especiais com um meio nutriente líquido à base de um meio Middlebrook-7H9 modificado. Para estimular o crescimento de micobactérias e suprimir o crescimento de microflora estranha, são utilizados o Suplemento de Crescimento MGIT e uma mistura de medicamentos antibacterianos PANTA.

O crescimento de microrganismos é registrado opticamente. Baseia-se na fluorescência, que ocorre quando as micobactérias consomem oxigênio durante seu crescimento. Um corante fluorocromo dependente de oxigênio é contido no fundo de um tubo de ensaio especial e coberto com uma camada de silicone. A reprodução das micobactérias leva a uma diminuição na quantidade de oxigênio no tubo de ensaio e uma diminuição em sua concentração, o que causa um aumento na fluorescência, que se torna visível quando o tubo de ensaio é irradiado com luz ultravioleta e é registrado automaticamente por fotossensores incorporados ao dispositivo VASTES-960. A intensidade da luminescência é registrada em unidades de crescimento (GU). Os dados de crescimento são inseridos automaticamente em um computador, onde podem ser salvos. A análise computacional das curvas de crescimento pode fornecer informações sobre a presença de vários pools de micobactérias, incluindo as não tuberculosas, e também ajuda a avaliar as propriedades de crescimento das micobactérias.

Como resultado da introdução desses sistemas, o tempo de crescimento das micobactérias foi significativamente reduzido, atingindo uma média de 11 dias no VASTEC-960 e 19 dias no MB/Bact, contra 33 dias em um meio nutriente denso padrão. Vale ressaltar que esses sistemas exigem pessoal altamente qualificado. A semeadura do material em meio líquido é necessariamente acompanhada pela semeadura no meio Lowenstein-Jensen, que desempenha o papel de reserva nos casos em que as micobactérias da tuberculose não crescem em outros meios.

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Determinação da suscetibilidade de micobactérias a medicamentos

A determinação do espectro e do grau de sensibilidade das micobactérias aos medicamentos antituberculose é de grande importância clínica, bem como para a avaliação epidemiológica da disseminação da tuberculose resistente aos medicamentos. Além disso, o monitoramento da resistência aos medicamentos permite avaliar a eficácia do programa antituberculose como um todo, sendo um indicador integral do desempenho de todos os componentes das medidas antituberculose.

Frequência e momento dos testes de suscetibilidade a medicamentos:

• antes do início do tratamento, uma vez para determinar a estratégia e as táticas de tratamento:
• Ao isolar culturas de vários materiais de um paciente (escarro, LBA, urina, exsudatos, líquido cefalorraquidiano, etc.), todas as cepas isoladas são examinadas:
• ao final da fase intensiva do tratamento na ausência de dinâmica clínica e radiológica:
• se for necessário alterar o regime de tratamento em caso de:
  • ausência de negatividade do escarro;
  • recultura após negatividade do escarro;
  • Um aumento acentuado na quantidade de BAAR em um esfregaço após uma diminuição inicial. É bem conhecido que cepas de Mycobacterium tuberculosis com diferentes sensibilidades a medicamentos são isoladas de material de um paciente com tuberculose. A sensibilidade das cepas aos medicamentos antituberculosos pode diferir no espectro de medicamentos, grau, frequência e velocidade de desenvolvimento de resistência.

O grau de resistência do Mycobacterium tuberculosis aos medicamentos é determinado de acordo com critérios estabelecidos, que se concentram na significância clínica da resistência e dependem da atividade antituberculosa do medicamento, sua farmacocinética, concentração na lesão, dose terapêutica máxima, etc.

A determinação da suscetibilidade de micobactérias aos medicamentos é atualmente realizada por meio de métodos microbiológicos:

• concentrações absolutas (método de diluição em meio nutriente sólido ou líquido),
• proporções,
• coeficiente de resistência.

Normalmente, a resistência se manifesta na forma de crescimento visual de colônias de Mycobacteria tuberculosis; no entanto, existem métodos que induzem o crescimento nos estágios iniciais da divisão celular micobacteriana na forma de reações de coloração. Esses métodos reduzem o tempo de teste de 3 a 4 para 2 semanas.

O método de concentração absoluta recomendado pelo Comitê de Quimioterapia da OMS tornou-se difundido na Rússia como um método unificado. Do ponto de vista metodológico, é o mais simples, mas requer alta padronização e precisão dos procedimentos laboratoriais. O teste de sensibilidade a medicamentos consiste em um conjunto de tubos de ensaio com meio nutriente modificado com medicamentos antituberculose. O conjunto consiste em 2 a 3 tubos de ensaio com diferentes concentrações de cada um dos medicamentos utilizados, um tubo de ensaio controle com meio sem o medicamento e um tubo de ensaio contendo 1000 μg/ml de salicilato de sódio ou 500 μg/ml de ácido paranitrobenzóico para detectar o crescimento de micobactérias não tuberculosas.

Para preparar um conjunto de meios com preparações, utiliza-se um meio de Lowenstein-Jensen modificado (sem amido), que é vertido em frascos. Um determinado volume da diluição correspondente do medicamento antituberculoso é adicionado a cada um dos frascos. O conteúdo dos frascos é bem misturado, vertido em tubos de ensaio e coagulado em posição inclinada por 40 minutos a uma temperatura de 85 °C. Recomenda-se coagular o meio em um coagulador elétrico com controle automático de temperatura. Meio com medicamentos antituberculosos

A 1ª linha pode ser armazenada em geladeira entre 2 e 4 °C por 1 mês, enquanto os medicamentos da 2ª linha podem ser armazenados por no máximo 2 semanas. O armazenamento de meios com medicamentos à temperatura ambiente é inaceitável. Ao preparar soluções de medicamentos antituberculose, sua atividade é levada em consideração, calculando-se a concentração com ajuste para o peso molecular da parte não específica do medicamento, pureza, etc. Para determinar a sensibilidade aos medicamentos, são utilizadas apenas substâncias quimicamente puras.

O princípio do método é determinar a concentração de um medicamento antituberculose que suprime o crescimento de uma parcela significativa da população de micobactérias. Quando realizado corretamente, este método apresenta boa confiabilidade.

Antes de realizar o teste, é necessário certificar-se de que a cultura isolada de Mycobacterium tuberculosis não contém microflora estranha. Uma suspensão homogênea contendo 500 milhões de corpos microbianos em 1 ml (padrão de turbidez óptica de 5 unidades) é preparada a partir da cultura de micobactérias em uma solução de cloreto de sódio a 0,9%. A suspensão resultante é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% (1:10) e 0,2 ml da suspensão é adicionado a cada tubo de ensaio do conjunto de meio nutriente. Os tubos de ensaio inoculados são colocados em um termostato a 37 °C e mantidos horizontalmente por 2 a 3 dias para que a superfície inclinada do meio nutriente seja inoculada uniformemente com a suspensão de Mycobacterium tuberculosis. Em seguida, os tubos de ensaio são movidos para a posição vertical e incubados por 3 a 4 semanas. Os resultados são registrados após 3 a 4 semanas.

Como o tempo necessário para isolar o patógeno do material clínico em meio nutriente é de pelo menos 1 a 1,5 mês, os resultados da determinação da suscetibilidade a medicamentos por este método só podem ser obtidos 2 a 2,5 meses após a semeadura do material. Esta é uma das principais desvantagens do método.

Os resultados dos testes de sensibilidade micobacteriana a medicamentos são interpretados com base em certos critérios. Em meios sólidos, uma cultura é considerada sensível à concentração do fármaco contido no meio se o número de colônias micobacterianas cultivadas em um determinado tubo de ensaio com o fármaco não exceder 20, com crescimento abundante em um tubo de ensaio controle sem fármacos. Somente se houver mais de 20 colônias, a cultura é considerada resistente a uma determinada concentração. Na prática, quando se obtêm resultados de crescimento em tubos de ensaio próximos a 20 UFC, é necessário notificar a unidade clínica de que a sensibilidade ou resistência neste caso é limítrofe, pois isso pode, às vezes, explicar a dinâmica pouco clara dos indicadores clínicos.

Para diversas preparações, estabelece-se uma determinada concentração na qual se observa a reprodução de uma proporção crítica da população micobacteriana. Essas concentrações são chamadas de "críticas". A magnitude do crescimento da população micobacteriana em um meio nutriente com a preparação em uma concentração crítica é utilizada como critério de estabilidade.

Na prática da tisiologia doméstica, ao determinar a resistência a medicamentos, não se limita a determinar apenas as concentrações críticas. Isso se deve ao fato de que uma definição ampliada do nível de resistência do patógeno aos medicamentos permite ao clínico formular táticas de quimioterapia mais corretamente, utilizando o conhecimento do efeito potencializador das combinações de medicamentos, para antecipar a resistência cruzada ou utilizar medicamentos mais eficazes do grupo de medicamentos antituberculose em uso.

O método da concentração absoluta é o mais simples, mas também o mais sensível a erros cometidos em sua implementação. Mais confiável, especialmente na determinação da sensibilidade a medicamentos de segunda linha, e amplamente difundido fora da Rússia, é o método da proporção. Ele leva em consideração as deficiências do método da concentração absoluta, mas sua implementação é mais trabalhosa.

O método é muito semelhante ao método de concentração absoluta. A preparação dos tubos de ensaio com os fármacos é a mesma do método de concentração absoluta. No entanto, a dose inicial da suspensão de micobactéria da tuberculose é reduzida em 10 vezes, o que elimina a frequência de resistência espontânea de algumas cepas de micobactéria da tuberculose a fármacos como etambutol, protionamida e capreomicina. Como controlo, são utilizados 2 ou 3 tubos com dose inicial igual à dos tubos de ensaio, diluídos sucessivamente 10 e 100 vezes. O critério de resistência é a proporção de crescimento visualmente observado da micobactéria da tuberculose. Para fármacos de primeira linha, o critério de resistência é o crescimento excessivo de 1% da população inicial; para fármacos de segunda linha, o crescimento de 1 ou mais de 10% da inicial, dependendo da concentração crítica selecionada.

Em 1997, o grupo de trabalho da OMS e da União Internacional Contra a Tuberculose sobre a detecção de resistência aos medicamentos antituberculose fez ajustes nesses critérios, propondo considerar como resistentes as micobactérias que crescem no meio denso de ovos de Lowenstein-Jensen nas seguintes concentrações:

• di-hidroestreptomicina - 4 μg/ml;
• isoniazida - 0,2 µg/ml:
• rifampicina - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

Em 2001, foram propostas concentrações críticas para os seguintes medicamentos de segunda linha (para uma proporção crítica de 1%):

• capreomicina - 40 mcg/ml;
• protionamida - 40 mcg/ml;
• canamicina - 30 μg/ml;
• viomicina - 30 μg/ml;
• cicloserina - 40 mcg/ml;
• ácido aminosalicílico - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacina - 2 mcg/ml.

Os resultados do crescimento são avaliados após 4 semanas como preliminares e após 6 semanas de cultivo como finais.

Para determinar a suscetibilidade à pirazinamida, amplamente utilizada na quimioterapia moderna contra tuberculose, a concentração crítica recomendada é de 200 μg/ml. No entanto, ainda não existe um método universalmente aceito para determinar a resistência a esse fármaco em meios nutritivos sólidos, uma vez que sua atividade antibacteriana se manifesta apenas em ambiente ácido (pH < 6), o que é tecnicamente difícil de manter. Além disso, muitas culturas clínicas de Mycobacterium tuberculosis relutam em crescer em meios de cultura de ovos com ambiente ácido.

Para avaliar a qualidade dos resultados da determinação da suscetibilidade de micobactérias aos medicamentos, recomenda-se o controle de cada novo lote do meio Lowenstein-Jensen por meio da determinação paralela da suscetibilidade da cepa padrão de museu H37Rv. Além disso, existem certos critérios microbiológicos que devem ser atendidos para que os métodos forneçam um resultado bem reproduzível e corretamente interpretado. Estes incluem a viabilidade da cultura de micobactérias da tuberculose, as regras para a obtenção de uma suspensão e suspensão homogêneas, as regras para a seleção de culturas de micobactérias da tuberculose e a representatividade da massa bacteriana selecionada. A confiabilidade da determinação da resistência aos medicamentos diminui com excreção bacteriana extremamente baixa.

Recentemente, o método de determinação da suscetibilidade a medicamentos usando sistemas automatizados foi reconhecido como promissor. Os mais avançados nessa área são os desenvolvimentos baseados no VASTEC MGIT-960. Nesse caso, a suscetibilidade de micobactérias da tuberculose aos medicamentos é determinada com base em um método de proporção modificado. Durante a determinação, a taxa de crescimento de micobactérias da tuberculose no tubo de controle e em tubos com medicamentos é comparada. Para determinar a suscetibilidade à estreptomicina, isoniazida, rifampicina e etambutol, são utilizados aditivos enriquecedores e antibióticos incluídos no kit SIRE. Para determinar a suscetibilidade à pirazinamida, é utilizado o kit PZA. Durante o teste, tubos de ensaio com medicamentos são inoculados com uma suspensão de micobactérias da tuberculose, bem como tubos de controle com uma diluição de 100 vezes da suspensão para todos os medicamentos, com exceção da pirazinamida, onde a diluição da suspensão é de 10 vezes. O critério de estabilidade é o indicador de crescimento de micobactérias de 100 GU quando o crescimento no tubo de controle atinge 400 GU (consulte "Métodos de cultura para isolamento de micobactérias"). Os resultados são registrados e interpretados automaticamente e definidos pelo programa inserido ou selecionado.

As concentrações finais no tubo de ensaio com meio nutriente líquido são utilizadas como concentrações críticas. Atualmente, concentrações críticas foram desenvolvidas tanto para medicamentos de primeira linha quanto para alguns de segunda linha. Vale ressaltar que a determinação da sensibilidade da micobactéria tuberculosa à cicloserina e ao ácido aminosalicílico é realizada apenas em meio nutriente à base de ovo.

Um protocolo detalhado para trabalhar com o sistema descrito permite testes de suscetibilidade a medicamentos tanto em cultura isolada (com meio nutriente denso) quanto utilizando o crescimento primário de micobactérias em tubo de ensaio MGIT. Esta última opção reduz significativamente o tempo necessário para a realização de estudos culturais, permitindo a obtenção de resultados completos da cultura de micobactérias da tuberculose (incluindo informações sobre suscetibilidade a medicamentos) em até 3 semanas após a coleta do material, enquanto o método tradicional só fornece esses resultados no 3º mês. Resultados rápidos, quando o paciente está na fase intensiva do tratamento, podem compensar o custo relativamente alto dos estudos.

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Diferenciação de micobactérias

Considerando que os meios de cultura utilizados não são estritamente seletivos, a diferenciação subsequente das micobactérias isoladas é considerada obrigatória. A necessidade de diferenciação das micobactérias se deve a uma série de características dos processos patológicos causados por representantes do gênero: diferentes cursos e desfechos da tuberculose e micobacteriose, e a presença de resistência natural a alguns fármacos antituberculosos.

É reconhecido que a identificação primária de micobactérias do complexo M. tuberculosis a partir de micobactérias não tuberculosas é realizada de acordo com as seguintes características: taxa de crescimento em meio nutriente denso, formação de pigmentos, morfologia da colônia, presença de resistência a ácidos e temperatura ótima para crescimento.

Infelizmente, não existe um único método laboratorial que possa distinguir de forma confiável micobactérias do complexo M. tuberculosis de outras micobactérias álcool-ácido resistentes; no entanto, uma combinação dos sinais descritos acima com os resultados de uma série de testes bioquímicos fornecidos abaixo permite a identificação de micobactérias do complexo M. tuberculosis com uma probabilidade de até 95%.

Para diferenciar micobactérias do complexo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii e outras) de micobactérias não tuberculosas de crescimento lento, são utilizados testes bioquímicos básicos para detectar a presença dos seguintes sinais:

• capacidade de produzir ácido nicotínico (teste de niacina):
• atividade da redutase do nitrato;
• catalase termoestável;
• crescimento em meio com salicilato de sódio (1 mg/ml).

Como teste adicional, também podem ser utilizados testes de crescimento em meio contendo 500 μg/ml de ácido para-nitrobenzóico ou 5% de cloreto de sódio.

Muitos laboratórios bacteriológicos identificam esses microrganismos apenas no nível complexo, o que se deve às capacidades limitadas dos laboratórios e às capacidades metodológicas dos especialistas.

Na prática, na maioria dos casos, os seguintes testes são suficientes para diferenciar M. tuberculosis de M. bovis: niacina, nitrato redutase, pirazinamidase e registro de crescimento em meio contendo 2 μg/ml de hidrazida do ácido tiofeno-2-carboxílico. Leva-se em consideração que as micobactérias do complexo M. tuberculosis são caracterizadas pelo seguinte conjunto de características:

• crescimento lento (mais de 3 semanas);
• temperatura de crescimento entre 35-37 ^o C;
• ausência de pigmentação (cor marfim);
• coloração ácido-resistente pronunciada;
• teste de niacina positivo;
• teste de nitrato redutase positivo;
• ausência de catalase termoestável (68 ^o C).
• ausência de crescimento em meio Lowenstein-Jensen contendo:
  • 1000 µg/ml de ácido salicílico sódico,
  • 500 mcg/ml de ácido para-nitrobenzóico,
  • 5% cloreto de sódio:
• crescimento na presença de 1-5 μg/ml de ácido tiofeno-2-carboxílico.

A relevância da diferenciação de micobactérias isoladas aumentará significativamente com o aumento da frequência de registro de casos de HIV/AIDS associados à tuberculose ou micobacteriose. Atualmente, não há certeza absoluta sobre a prontidão dos laboratórios regionais para realizar corretamente esse volume de trabalho.

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Diagnóstico imunológico da tuberculose

Há uma série de fenômenos universais, preparações e testes imunológicos que foram inicialmente descobertos especificamente na tuberculose ou no modelo de resposta imune a micobactérias. Estes incluem o BCG e a tuberculina, fenômenos como os DST cutâneos (testes tuberculínicos - reações de Pirquet e Mantoux) e a reação à administração subcutânea de tuberculina em animais sensibilizados (fenômeno de Koch). Alguns dos primeiros anticorpos em doenças infecciosas também foram descobertos na tuberculose. É claro que, quanto mais profunda a compreensão dos mecanismos de imunidade antituberculosa e seu controle genético, mais amplo pode ser o uso de métodos imunológicos e preparações que afetam a imunidade para a solução de problemas práticos de tisiologia.

O problema prático mais importante e complexo atualmente é considerado a detecção da tuberculose no processo de triagem em massa da população. No entanto, apesar dos inúmeros relatos de "sucessos" (com material limitado), não existe um método imunológico (reproduzível em "qualquer mão") ou medicamento adequado para esses fins.

Métodos imunológicos, em particular estudos sorológicos (determinação de antígenos, anticorpos) e testes de provocação tuberculínica, são amplamente utilizados na prática clínica.

Os métodos sorológicos, que determinam antígenos e anticorpos em diferentes ambientes do corpo, estão em primeiro lugar entre os estudos imunológicos utilizados no diagnóstico diferencial.

A especificidade da determinação de anticorpos contra Mycobacterium tuberculosis depende dos antígenos utilizados na imunoanálise. Um número significativo de antígenos foi proposto, sendo o primeiro deles o PPD da tuberculina:

• PPD e outras preparações complexas de fluido de cultura;
• desintegrante ultrassônico;
• Extrato de Triton e outras preparações complexas de parede celular;
• 5-antígeno (Daniel);
• 60-antígeno (Coccito);
• lipoarabinomanano;
• fator de corda (trealose-6,6-di-micolato);
• glicolipídios fenólicos e outros;
• lipopolissacarídeos;
• antígeno de ligação à fibronectina;
• proteínas (na maioria das vezes recombinantes); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, etc.

Como resultado de muitos anos de pesquisa por cientistas russos e estrangeiros, os principais padrões de formação de anticorpos e a eficácia do diagnóstico sorológico da tuberculose foram identificados: quanto mais complexo o antígeno, maior a sensibilidade e menor a especificidade dos testes. A especificidade varia em diferentes países, dependendo da infecção da população com M. tuberculosis e micobactérias não tuberculosas, da vacinação com BCG, etc. Em crianças, a informatividade do sorodiagnóstico é menor do que em adultos. Na tuberculose primária (mais frequentemente em crianças), a determinação de IgM é mais informativa; na tuberculose secundária, a de IgG. Em pessoas infectadas pelo HIV, a informatividade do sorodiagnóstico na determinação de anticorpos é reduzida. A eficácia da determinação de anticorpos depende de uma série de "momentos clínicos": a atividade do processo (presença ou ausência de "isolamento" de micobactérias, presença de cavidades de decomposição, grau de infiltração), prevalência do processo, duração de seu curso.

A sensibilidade do método de ensaio imunoenzimático (EIA) é de cerca de 70%. A eficácia insuficiente do estudo se deve à sua baixa especificidade. Anteriormente, foram consideradas as possibilidades de utilização da triagem sorológica em grupos de alto risco, em particular entre pessoas com alterações pulmonares pós-tuberculose.

Para aumentar a especificidade do ELISA, buscam-se antígenos mais específicos, incluindo aqueles obtidos por engenharia genética: ESAT-6, etc. (ver acima). O uso de antígenos estritamente específicos (38 kDa, ESAT) aumenta a especificidade, mas reduz significativamente a sensibilidade da análise. Além do ELISA (sistemas de testes laboratoriais experimentais, como o kit Pathozyme ELISA), também são oferecidos kits imunocromatográficos com filtração lateral (Mycodot), bem como outros testes semelhantes (análise de pontos de membrana) com avaliação visual do resultado do teste. Ao realizar esses testes, a análise leva de 10 a 30 minutos; eles não requerem equipamento especial, mas requerem avaliação visual dos resultados, o que está associado a uma certa subjetividade. Esses métodos têm aproximadamente as mesmas características de sensibilidade e especificidade (70% e 90-93%, respectivamente) que o ELISA tradicional.

O uso de métodos de imunoanálise tem certo valor como método adicional considerado no complexo de métodos utilizados no diagnóstico diferencial da tuberculose, especialmente no diagnóstico de suas formas extrapulmonares. O método ELISA é mais eficaz no diagnóstico de meningite tuberculosa ao examinar o líquido cefalorraquidiano. Nesse caso, a sensibilidade da análise é de 80-85% e a especificidade de 97-98%. Há informações sobre a eficácia da determinação de anticorpos contra Mycobacterium tuberculosis no fluido lacrimal no diagnóstico de uveíte tuberculosa.

Indução da síntese de interferon gama in vitro

O interferon gama (IFN-γ) é um fator de proteção imunológica específica, realizado pela ativação dos sistemas enzimáticos dos macrófagos. A indução da síntese de IFN-γ por linfócitos T sensibilizados é causada por sua interação com antígenos micobacterianos.

Tanto a PPD da tuberculina quanto antígenos específicos obtidos por engenharia genética são utilizados como antígenos, em particular o antígeno ESAT-6 (antígeno secretado precocemente com peso molecular de 6 kDa) e o CFP-10 (proteína do filtrado da cultura, 10 kDa). Antígenos geneticamente modificados ou recombinantes estão ausentes nas células da vacina BCG e de outras micobactérias. Ao usar a tuberculina, os resultados do teste de indução de IFN-γ são comparáveis aos resultados do teste cutâneo da tuberculina (correlação direta). Ao usar antígenos geneticamente modificados, os resultados do teste são mais específicos e não dependem da vacinação anterior com BCG. Ao examinar indivíduos vacinados que não tiveram contato com a infecção por tuberculose, a especificidade do teste é de 99%. A sensibilidade do teste em pacientes com tuberculose varia de 81 a 89%.

Testes e diagnósticos foram desenvolvidos com base no cultivo de curto prazo de células sanguíneas totais ou células mononucleares isoladas de sangue com antígenos de micobactérias da tuberculose in vitro, seguido pela determinação da concentração de IFN-γ ou contagem do número de linfócitos T que sintetizam IFN-γ. A concentração de interferon sintetizado em um tubo de ensaio é determinada por ELISA, utilizando anticorpos monoclonais que se ligam a IFN-γ. Em seguida, utilizando a calibração do IFN-γ padrão, sua concentração nos poços do tubo de ensaio ou da placa é determinada.

No teste Elispot, o número de células T sintetizando IFN-γ é contado na superfície de uma placa revestida com anticorpos para IFN-γ.

Os desenvolvedores do diagnóstico de indução in vitro de IFN-γ, aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA, afirmam que o teste não consegue diferenciar a infecção latente por tuberculose da tuberculose ativa. Portanto, em regiões com alta taxa de infecção, o teste não tem valor diagnóstico direto. No entanto, em nosso país, ele pode ser usado para diferenciar a infecção por tuberculose em crianças da alergia pós-vacinação, bem como para avaliar o nível de imunidade específica durante o tratamento.

Atualmente, um sistema de teste doméstico para determinar a indução da síntese de IFN-γ por antígenos específicos da tuberculose in vitro está em estudo.

Estado imunológico e curso da tuberculose, imunocorreção

Durante o tratamento da tuberculose, ocorrem alterações na antigenemia e no estado do sistema imunológico das pessoas.

Os dados sobre alterações em exsudatos e tecidos são amplamente contraditórios. A única coisa que pode ser observada com plena justificação é que os granulomas tuberculosos, via de regra, contêm um número significativo de linfócitos T ativados.

Faz sentido abordar mais dois pontos necessários para compreender o papel dos mecanismos imunológicos no tratamento da tuberculose em humanos:

• Pacientes com AIDS têm uma incidência particularmente alta de desenvolvimento de resistência a múltiplos medicamentos;
• Em caso de resistência a múltiplos medicamentos (e na ausência de infecção pelo HIV), os distúrbios imunológicos (principalmente a imunidade das células T) são particularmente significativos.

Na tuberculose, vários métodos de imunocorreção são amplamente utilizados: em primeiro lugar, são medicamentos que atuam principalmente na imunidade das células T e no sistema fagocitário mononuclear (hormônios do timo, isofona, licopídeo, polioxidônio, etc.), bem como micobactérias inteiras (atenuadas) e seus componentes.

Diagnóstico biológico molecular da tuberculose

Os métodos de biologia molecular no diagnóstico de doenças infecciosas incluem principalmente métodos baseados na manipulação de materiais genômicos de patógenos bacterianos e virais para identificar material genético específico – seções de DNA com uma sequência de nucleotídeos específica para uma determinada espécie ou cepa de patógeno – para analisar sequências específicas de DNA em genes que determinam a sensibilidade do patógeno a determinados medicamentos, bem como para analisar a atividade funcional de certos genes do patógeno. Os métodos de biologia molecular tornaram-se amplamente difundidos na pesquisa científica e na aplicação prática no diagnóstico e monitoramento de diversas infecções bacterianas e virais após a descoberta da reação em cadeia da polimerase em 1985 por Carrie Mullis (Prêmio Nobel de 1989).

Princípios e capacidades do método de reação em cadeia da polimerase

A PCR permite a amplificação (multiplicação) de uma sequência de nucleotídeos (um fragmento de DNA de um patógeno) em um tubo de ensaio, milhões de vezes, em poucas horas. A realização da reação na presença de cadeias únicas de DNA determina a sensibilidade excepcionalmente alta da análise.

A sequência de nucleotídeos de certas seções da cadeia de DNA determina a singularidade genética do microrganismo, o que explica a alta especificidade da PCR.

A importância deste método para a detecção e estudo das características do Mycobacterium tuberculosis se deve às características biológicas do microrganismo, que tem crescimento muito lento: o tempo de duplicação do DNA do Mycobacterium tuberculosis durante seu cultivo é de 12 a 24 horas.

O princípio do método PCR é a amplificação - multiplicação múltipla, milhões de vezes, de seções de uma sequência específica de DNA em um microvolume de tubo de ensaio com repetição cíclica dos três estágios de reação a seguir, cada um dos quais ocorre em um regime de temperatura diferente:

• Estágio I - desnaturação do DNA fita dupla por aquecimento com divergência de suas cadeias;
• Estágio II - ligação complementar (hibridização) de primers (oligonucleotídeos de priming) com as seções finais das cadeias de um fragmento de DNA estritamente específico selecionado para amplificação;
• Estágio III – conclusão da cadeia do fragmento de DNA usando DNA polimerase termoestável.

Para a amplificação, o tubo de ensaio deve conter moléculas de DNA matriz. Quatro tipos de desoxinucleosídeos trifosfatos (nucleotídeos) contendo as bases nitrogenadas correspondentes: adenina (A), timina (T), guanina (G), citosina (C); oligonucleotídeos de iniciação (primers) sintetizados artificialmente, consistindo de 18 a 20 pares de bases; uma enzima termoestável, a DNA polimerase, com temperatura ótima de 68 a 72 ^° C, e íons de magnésio.

A especificidade da PCR depende da escolha do fragmento de DNA. De acordo com ela, oligonucleotídeos primers flanqueadores são sintetizados. A especificidade da hibridização e da completação da cadeia de DNA é determinada pelo princípio da complementaridade dos seguintes pares de bases nitrogenadas: adenina-timina, guanina-citosina.

Para determinar o genoma da micobactéria do complexo da tuberculose, o alvo de amplificação mais eficaz na maioria dos sistemas de teste é o fragmento de DNA IS6110, que na maioria das cepas de micobactérias da tuberculose apresenta um número significativo (10-20) de repetições no genoma, o que garante, além da especificidade, alta sensibilidade da análise. Ao mesmo tempo, cepas de micobactérias da tuberculose com pequeno número de repetições ou ausência do fragmento IS6110 foram descritas.

Extração de moléculas de DNA de uma amostra biológica

Para realizar a PCR, as moléculas de DNA do patógeno devem ser isoladas do material biológico em um volume mínimo, com uma quantidade mínima de DNA não específico e vários inibidores da enzima - DNA polimerase.

A preparação das amostras deve ser realizada em condições que impeçam a contaminação cruzada das amostras em estudo com moléculas de DNA isoladas. Isso requer o tratamento prévio da sala com luz ultravioleta, pisos e superfícies de trabalho de mesas e aparelhos com soluções contendo cloro. Também é necessário o uso de luvas limpas, tubos de ensaio descartáveis e pontas para pipetas automáticas.

Para isolar o DNA do Mycobacterium tuberculosis de amostras clínicas (líquido cefalorraquidiano, lavado brônquico) que não contenham grande número de leucócitos, restos celulares ou sais, basta centrifugar a amostra a 3-4 mil rotações por minuto, adicionar 20-30 µl de uma solução de Triton X-100 a 2% ao sedimento e aquecer a 90 ^o C por 30 minutos.

A preparação da amostra de escarro requer liquefação eficiente, tipicamente utilizando hidróxido de sódio a 4% e N-acetil-L-cisteína (NALC) a 50-80 mg por amostra, dependendo da viscosidade da amostra. A solução de NALC deve ser preparada ex tempore, ou o pó de NALC pode ser adicionado seco diretamente à amostra. Após a liquefação, as amostras devem ser centrifugadas por 15 minutos a 3.500-4.000 rpm (3.000 g) em tubos de 50 ml com tampa de rosca, ou seja, nas mesmas condições recomendadas para a preparação de escarro para pré-cultura.

Para extrair DNA de sedimentos, o método mais frequentemente utilizado é o uso de uma solução 5-6 molar de isotiocianato de guanidina como reagente de lise e partículas microporosas de óxido de silício ("terra diatomácea") que sorvem moléculas de DNA. Substâncias não específicas, incluindo possíveis inibidores, são então lavadas em uma solução 2,5 molar de isotiocianato de guanidina e uma solução de etanol. Em seguida, as moléculas de DNA são dessorvidas em água, e essas amostras são usadas para realizar a PCR. Para simplificar a tecnologia de extração de DNA, a "terra diatomácea" é frequentemente substituída por micropartículas magnéticas revestidas com óxido de silício. Nesse caso, um suporte magnético especial para microtubos é usado para precipitar as partículas em vez de centrifugação.

Um método original de separação imunomagnética de micobactérias com subsequente extração de DNA do patógeno foi desenvolvido na Rússia. Para a separação imunomagnética de micobactérias da tuberculose, são utilizadas partículas de ferro de 3 a 5 μm, revestidas com óxido de silício, às quais anticorpos policlonais (de coelho) contra micobactérias da tuberculose são fixados por meio de uma ligação química. Amostras de escarro após lise alcalina são neutralizadas com uma solução ácida de Tris-HCl e incubadas com um sorvente imunomagnético. Em seguida, as imunoferropartículas são coletadas usando uma haste magnética com ponta substituível, transferidas para um microtubo e precipitadas. 20 a 30 μl de uma solução de Triton X-100 a 2% são adicionados e aquecidos por 30 minutos a 90 ^° C. O sobrenadante é usado como matriz de DNA para análise de PCR.

Um problema complexo é a extração de DNA do Mycobacterium tuberculosis de amostras de biópsia. Para a lise da biópsia, a enzima proteinase K é utilizada em uma concentração final de 200-500 mg/l a uma temperatura de 56 ^° C durante a noite. Em seguida, a extração é feita usando um dos métodos conhecidos. O excesso de DNA não específico na análise de PCR de amostras de biópsia frequentemente causa inibição da reação, o que requer repetidas extrações de DNA.

Métodos de detecção de resultados

Após a conclusão da reação, os fragmentos amplificados do DNA do patógeno são identificados usando vários métodos.

O método de eletroforese em gel é bem conhecido. Neste caso, o fragmento de DNA obtido é identificado por um controle positivo contendo o fragmento de DNA específico desejado, ou por um tamanho previamente conhecido (número de pares de nucleotídeos) do fragmento, que é determinado usando um marcador molecular padrão.

Na presença de um corante específico - brometo de etídio, que está incluído no DNA de fita dupla, o fragmento de DNA sintetizado é revelado como uma faixa que brilha sob a influência da luz ultravioleta.

O tamanho do fragmento de DNA, determinado por eletroforese com base na distância percorrida desde o início, deve corresponder a um marcador de peso molecular conhecido ou controle positivo.

Outros métodos para determinar resultados de PCR são baseados na hibridização de produtos de PCR de fita simples com um oligonucleotídeo complementar - uma sonda de DNA marcada com biotina, seguida pela detecção usando uma reação enzimática, por exemplo, ligando um conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina à biotina.

Com base nesse tipo de detecção, foram criados analisadores de PCR nos quais a detecção dos resultados de PCR é realizada automaticamente como resultado da leitura da densidade óptica nas amostras após a ocorrência da reação enzimática.

As desvantagens desses métodos incluem a possibilidade de contaminação intralaboratorial com fragmentos relativamente curtos de moléculas de DNA. Quando essas moléculas entram em amostras recém-testadas, elas se tornam uma matriz para PCR e levam a resultados falso-positivos.

Nesse sentido, para evitar resultados falso-positivos, são introduzidas regras rigorosas para a separação e isolamento de salas: para extração de DNA de amostras biológicas; salas para detecção de resultados (eletroforese) da zona limpa. Essas salas representam uma zona de provável contaminação. Outra zona isolada é uma sala limpa para introdução das amostras de DNA em estudo em tubos de ensaio com a mistura de reação para PCR. E, por fim, presume-se que o dispositivo principal – o amplificador de DNA – deve ser levado para uma sala separada, possivelmente um escritório.

Para evitar a contaminação pelos produtos de reações anteriores – amplicons – alguns sistemas de teste de PCR contêm desoxinucleosídeo uridina em vez de desoxinucleosídeo timidina, que é construída na posição correspondente durante a síntese da cadeia in vitro, ou seja, a base nitrogenada timina presente no DNA nativo é substituída por uracila. A uracila DNA glicosilase adicionada à mistura de reação do material analisado destrói apenas os fragmentos contaminantes com desoxiuridina, mas não o DNA nativo analisado contendo desoxitimidina. O aquecimento subsequente a 94 ^° C inativa essa enzima e não interfere na amplificação na PCR.

Existe um sistema de teste baseado na amplificação isotérmica de rRNA, para o qual são realizadas primeiramente a transcrição reversa e a síntese de moléculas de DNA, que por sua vez são a matriz para a síntese subsequente de moléculas de RNA. Os amplicons de RNA são detectados usando uma sonda de DNA corada com acridina durante a hibridização em uma solução de tubo de reação. Este método, além da alta sensibilidade, tem a vantagem de realizar a análise em um único tubo, o que evita a contaminação. Segundo os autores, a sensibilidade deste método em amostras respiratórias atinge 90%, com uma especificidade de 99-100%.

Novos métodos de detecção são implementados na PCR em tempo real. Esses métodos se diferenciam principalmente pelo fato de a PCR e a detecção de seus resultados serem realizadas simultaneamente em um tubo de ensaio fechado. Isso não apenas simplifica tecnologicamente o método de análise, como também evita a contaminação das instalações do laboratório e das amostras por produtos de PCR anteriores.

Na PCR em tempo real, os resultados são detectados pela fluorescência resultante da hibridização de uma sonda de DNA fluorogênica com um fragmento de DNA específico amplificado durante a PCR. A estrutura das sondas de DNA fluorogênicas é construída de tal forma que o marcador fluorescente é liberado como resultado de uma reação enzimática ou se distancia da molécula supressora de fluorescência somente após a hibridização específica com a molécula de DNA desejada amplificada durante a PCR. À medida que o número de moléculas hibridizadas com a sonda aumenta, o aumento da fluorescência para um nível detectável é proporcional ao número de moléculas do produto amplificado. Como o número de moléculas de fragmentos de DNA é duplicado durante cada ciclo de PCR, o número de ciclos a partir do qual a fluorescência é detectada e aumenta é inversamente proporcional ao número de moléculas de DNA na amostra original. Se várias concentrações conhecidas diferentes de moléculas do fragmento correspondente de DNA do mycobacterium tuberculosis forem introduzidas na reação como um calibrador, o número de genomas de DNA no material em estudo pode ser calculado usando um programa de computador.

Cada amostra padrão é duplicada. O critério quantitativo é o número mínimo de ciclos de PCR necessários para o início e o crescimento da fluorescência detectável. O eixo das abcissas é o número de ciclos; o eixo das ordenadas é o valor da fluorescência. As concentrações de DNA são inversamente proporcionais ao número de ciclos necessários para o aparecimento da fluorescência. As janelas na coluna da direita (21-32) mostram os números dos ciclos para as concentrações correspondentes. As diferenças entre as concentrações de 10 vezes dos fragmentos de DNA 10 ² -10 ⁶ ml são de 3,2-3,4 ciclos. Para dois pacientes, as concentrações dos fragmentos IS6110 foram de cerca de 10 ³ /ml e 10 ⁴ /ml. Levando em consideração o número de repetições (6-20) dos fragmentos analisados no genoma do Mycobacterium tuberculosis, o número de Mycobacterium tuberculosis nas amostras clínicas é de cerca de 100 e 1000 células, respectivamente.

Aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose

O método de PCR é amplamente utilizado para o diagnóstico rápido da tuberculose – detecção de Mycobacterium tuberculosis em amostras clínicas: escarro, lavados brônquicos, exsudato pleural, urina, líquido cefalorraquidiano, punções de osteólise, aspirados do trato genital feminino e diversas biópsias. Em um estudo realizado na Holanda, com cerca de 500 amostras de escarro e lavados brônquicos de 340 pacientes com diagnóstico confirmado de tuberculose pulmonar, foi estudada a sensibilidade comparativa dos métodos de PCR, cultura e baciloscopia. A sensibilidade da análise foi de 92,6%, 88,9% e 52,4%, respectivamente. A especificidade de todos os métodos foi de cerca de 99%.

Foi comparada a eficiência da detecção de Mycobacterium tuberculosis por meio de baciloscopia, semeadura em meio Lowenstein-Jensen, sistema de teste VASTES e análise por PCR. A PCR demonstrou sensibilidade de 74,4%, a microscopia - 33,8%, a semeadura em meio sólido - 48,9% e o VASTES - 55,8%. O tempo médio de detecção para semeadura em meio Lowenstein-Jensen é de 24 dias. VASTES - 13 dias, PCR - 1 dia.

O potencial do uso da PCR como um método sensível e rápido para monitorar a eficácia do tratamento da tuberculose também é discutido.

A detecção do DNA do Mycobacterium tuberculosis pelo método de PCR com quimioterapia eficaz é determinada ao longo de um período de tempo mais longo - em média 1,7 meses em comparação com a excreção bacteriana determinada por microscopia de fluorescência e 2,5 meses em comparação com o exame bacteriológico.

Diagnóstico das formas extrapulmonares da tuberculose

A importância da PCR como método sensível é especialmente grande para as formas extrapulmonares, pois é justamente nessas formas que os métodos clínicos e radiológicos e os métodos bacteriológicos tradicionais para determinação de Mycobacterium tuberculosis em materiais diagnósticos são ineficazes.

Ao examinar amostras de urina, os resultados da análise de PCR foram positivos em 16 de 17 pacientes com tuberculose ativa do sistema urinário e negativos em 4 pacientes com tuberculose renal inativa e 39 pacientes com doenças não tuberculosas do sistema urinário.

Foi demonstrada a eficiência da análise de PCR no estudo de aspirados de medula óssea em pacientes com febre de origem desconhecida e suspeita de tuberculose. Para o diagnóstico de linfadenite tuberculosa em crianças, foram estudados 102 aspirados por punção e amostras de biópsia de 67 crianças com suspeita de linfadenite tuberculosa. Foram obtidos resultados positivos: 71,6% por PCR em tempo real, 46,3% por microscopia de fluorescência e 41,8% por cultura. No estudo de 50 biópsias de linfonodos em pacientes com doença da arranhadura do gato, todos os resultados foram negativos. Assim, foi demonstrada a especificidade de 100% da análise de PCR. No mesmo trabalho, foi demonstrada a possibilidade de detecção de M. avium em biópsias por punção de linfonodos.

O diagnóstico de tuberculose genital feminina na infertilidade é conhecido por ser um dos problemas diagnósticos mais difíceis. Resultados positivos foram obtidos em estudos de PCR de biópsias endometriais, aspirados endometriais e amostras de fluido da bolsa de Douglas em 14 (56%) de 25 pacientes examinadas laparoscopicamente com suspeita de tuberculose. A baciloscopia e os estudos de cultura produziram 1 e 2 resultados positivos, respectivamente. Esses casos também foram PCR-positivos. A maioria dos resultados PCR-positivos ocorreu em casos com características de tuberculose de acordo com o exame histológico; um número menor ocorreu em casos com suspeita de tuberculose de acordo com a laparoscopia. Apenas um resultado PCR positivo foi obtido na ausência de dados laparoscópicos para tuberculose.

Ao diagnosticar formas extrapulmonares de tuberculose, os médicos frequentemente se questionam sobre a possibilidade de identificar o patógeno ao examinar amostras de sangue pelo método de PCR. Dados da literatura indicam que a detecção do DNA do Mycobacterium tuberculosis em amostras de sangue é possível em formas avançadas de infecção pelo HIV. O DNA do Mycobacterium tuberculosis foi detectado apenas na tuberculose generalizada de vários órgãos em pacientes com rim transplantado e imunossupressão.

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Identificação de espécies de micobactérias

O método de PCR pode ser bastante eficaz para a identificação rápida de micobactérias do complexo da tuberculose e de alguns tipos de micobactérias não tuberculosas após a obtenção do crescimento primário. Nesse caso, o uso da PCR pode economizar de 7 a 10 dias, necessários para a identificação cultural subsequente de um resultado positivo. O estudo de PCR é tecnicamente muito simples, pois não requer preparação complexa de amostras de material clínico para atingir alta sensibilidade. Ao examinar 80 culturas positivas em tal sistema de teste (MB BacT. da Organon), todos os resultados positivos da análise de PCR foram estritamente específicos e realizados em 1 dia. Para identificar outros tipos de micobactérias quando obtidas em cultura, o DNA do patógeno é hibridizado com sondas de DNA específicas marcadas com acridina, e as cepas são detectadas pelo aparecimento de quimioluminescência usando um quimioluminômetro ou em tiras de nitrocelulose com avaliação visual após a hibridização. Este kit identifica um número limitado de espécies: complexo Mycobacterium tuberculosis, M. avium, complexo M. avium, M. kansasii e M. gordonae.

A. Telenti et al. também desenvolveram um método relativamente simples e barato para identificação de espécies de micobactérias clinicamente importantes com base em PCR e tratamento subsequente com duas enzimas de restrição (enzimas que têm a capacidade de cortar uma molécula de DNA em pontos específicos). Neste caso, um fragmento de DNA que codifica uma proteína de choque térmico (65 kDa) é amplificado, após o qual o fragmento de DNA obtido em PCR, 439 pares de nucleotídeos de tamanho, é tratado separadamente com duas enzimas - Bste II e Nae III. Em seguida, usando eletroforese em gel de agarose, os dois produtos obtidos são analisados, determinando seus tamanhos (número de pares de nucleotídeos) usando um conjunto de fragmentos de DNA padrão (marcadores moleculares de DNA) de 100 a 1000 pares de nucleotídeos de comprimento. Em cada uma das espécies definidas (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) 2 ou 3 fragmentos de DNA de tamanhos diferentes são encontrados para cada enzima de restrição. A combinação dos fragmentos de DNA resultantes de diferentes tamanhos permite que essas espécies sejam diferenciadas umas das outras.

Uma tecnologia para microarranjos biológicos de DNA está sendo desenvolvida para ajudar a identificar mais de 100 espécies de micobactérias em um único estudo.

A identificação das espécies também pode ser realizada por meio da amplificação por PCR da região variável do 16S rRNA seguida do sequenciamento dos amplicons em comparação com a estrutura primária correspondente, o que permite a identificação de mais de 40 espécies de micobactérias.

A PCR também pode ser usada para identificar espécies dentro do complexo Mycobacterium tuberculosis, incluindo a diferenciação entre M. bovis e M. bovis BCG. Isso é feito analisando a presença ou ausência de certos genes nas regiões genômicas RD1, RD9 e RD10. RD1 está ausente no BCG de M. bovis, mas está presente em espécies virulentas, incluindo M. bovis.

Determinação da suscetibilidade de Mycobacterium tuberculosis a medicamentos usando PCR

As tarefas dos métodos genéticos moleculares para determinar a sensibilidade ou resistência do Mycobacterium tuberculosis a medicamentos se resumem à identificação de mutações em determinadas sequências de nucleotídeos de genes conhecidos. Os principais métodos baseiam-se na leitura direta (sequenciamento) dessas sequências após a amplificação ou na hibridização de fragmentos de DNA marcados com biotina, amplificados durante a PCR com sondas de DNA. Ambas as opções envolvem a identificação de substituições em sequências de nucleotídeos que, ao utilizar sondas de DNA, levam à ausência ou à hibridização incompleta em uma membrana de nitrocelulose, utilizando um conjugado enzimático (estreptavidina-fosfatase alcalina) – o método LIPA-Rif-TB.

O método de medição da fluorescência em sondas de DNA fixadas localmente em microrregiões complementares a mutações conhecidas em regiões gênicas amplificadas por PCR responsáveis pela sensibilidade ou resistência a medicamentos é chamado de método de microbiochips. O algoritmo básico para a condução deste estudo é o seguinte. Após o isolamento do DNA de uma amostra clínica ou cultura micobacteriana, a PCR deve ser realizada para amplificar os fragmentos correspondentes do gene groB, responsável pela sensibilidade à rifampicina, ou os genes katG e inhA, que codificam proteínas micobacterianas responsáveis pela sensibilidade à isoniazida. Os resultados da PCR são avaliados por eletroforese em gel de agarose, que confirma o recebimento dos fragmentos de DNA correspondentes com o comprimento desejado. Em seguida, uma segunda rodada de PCR é realizada para introduzir um marcador fluorescente no DNA. Os resultados da PCR são novamente confirmados por eletroforese em gel. Em seguida, realiza-se a hibridização (incubação durante a noite) com posterior lavagem do material obtido em um biochip, que consiste em um grande número de cadeias curtas de DNA (sondas) fixadas em uma pequena placa de vidro, complementares às sequências de nucleotídeos da micobactéria tuberculosa sensível a medicamentos nos pontos de possíveis mutações, bem como às sequências mutantes responsáveis pela resistência aos medicamentos. A localização das sondas de DNA na placa é estritamente definida, e o nível de fluorescência observado durante a hibridização é estabelecido para determinar o resultado usando um dispositivo de leitura especial. Para isso, os resultados da análise são determinados usando um programa de computador especial.

Nos últimos anos, métodos alternativos para determinar a sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis aos medicamentos foram desenvolvidos com base na tecnologia de PCR em tempo real, permitindo que esses estudos sejam realizados em tubo de ensaio fechado.

A Figura 13-13 mostra o resultado da análise de culturas clínicas de Mycobacterium tuberculosis na determinação da resistência aos medicamentos rifampicina usando PCR em tempo real: 218 - amostra controle (sensível à rifampicina); 93 - controle positivo para a mutação Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - controle positivo para a mutação Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - amostras experimentais. O resultado do cálculo das curvas cinéticas de amplificação para 4 canais: canal 1: 393 - controle positivo para a mutação Ser-Trp TCG-TGG; canal 2: 4482 - controle positivo para a mutação Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - amostras experimentais; canal 4: curvas cinéticas de amplificação de todas as amostras participantes do experimento. Controle positivo da reação de amplificação. Conclusões: A análise revelou as seguintes mutações que determinam resistência à rifampicina: nas amostras 162, 163, 172 e 295 - Ser-Leu TCG-TTG. O mesmo princípio foi utilizado para determinar a resistência à isoniazida pelos genes katG e inhA, que determinam as mutações mais frequentes.

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Identificação da cepa de Mycobacterium tuberculosis

O método mais estudado para identificação de cepas de Mycobacterium tuberculosis é uma tecnologia chamada polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), que se baseia na fragmentação (restrição) do DNA de Mycobacterium tuberculosis pela enzima Pvu II e subsequente hibridização dos fragmentos obtidos com certas sequências específicas no DNA de seu elemento repetido IS6110. A variabilidade intraespecífica é percebida devido ao número diferente de repetições IS6110 e sua localização no DNA, bem como à diversidade de distâncias entre certos pontos de ataque da enzima de restrição (sítios de restrição) e o elemento IS6110. Essa tecnologia é muito complexa e trabalhosa. Após o tratamento do DNA isolado da cultura de micobactérias da tuberculose com enzima de restrição, é realizada a eletroforese em gel, então fragmentos de DNA de diferentes comprimentos são transferidos para uma membrana de nitrocelulose, hibridizados com fragmentos do elemento IS6110, e os resultados são detectados usando uma reação enzimática. O padrão de bandas específico resultante caracteriza o DNA de uma cepa específica de micobactéria da tuberculose. A análise computacional revela a identidade ou a relação das cepas. Apesar de o método RFLP ser o mais discriminatório, ou seja, revelar o maior número de diferenças nas cepas analisadas, ele é ineficaz com um pequeno número (menos de 5) de repetições IS6110, observado em algumas cepas. As Figuras 13-14 mostram os resultados da tipagem RFLP das cepas.

Uma alternativa pode ser o método de spoligotipagem – análise do polimorfismo de sequências espaçadoras de DNA – intermediárias entre repetições diretas da região DR. Ao realizar a spoligotipagem de cepas, a PCR é realizada com primers que limitam a região DR, após o que são formados fragmentos de diferentes comprimentos, que hibridizam com regiões intermediárias variáveis de DNA. A análise de sequências espaçadoras da região DR parece, segundo os pesquisadores, mais simples, produtiva e adequada para a triagem primária de cepas e análise epidemiológica preliminar, bem como para o estudo direto de material clínico.

Obviamente, um método mais eficaz e tecnologicamente acessível é o VNTR (abreviação de palavras em inglês), ou o método de determinação do número variável de repetições exatas em tandem no DNA do Mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se apenas no uso de PCR e não requer manipulações adicionais. Como o número de repetições em tandem varia em diferentes cepas e em diferentes loci, fragmentos de diferentes tamanhos são determinados e analisados no eletroforegrama resultante dos produtos de PCR. Segundo os pesquisadores, com o auxílio do VNTR, obtém-se um maior grau de discriminação de cepas do que com o método RFLP.

Muita atenção tem sido dada nos últimos anos à disseminação de cepas de Mycobacterium tuberculosis da família W-Beijing (às vezes chamada de cepa Beijing), que são amplamente resistentes a medicamentos.

Requisitos básicos para a qualidade da pesquisa em biologia molecular

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Principais documentos regulatórios para a realização de PCR

Portarias do Ministério da Saúde da Federação Russa: nº 45 de 7 de fevereiro de 2000; nº 109 de 21 de março de 2003; nº 64 de 21 de fevereiro de 2000. Diretrizes: 1.3.1888-04 "Organização do trabalho durante a pesquisa de PCR de material infectado com agentes biológicos patogênicos dos grupos de patogenicidade III-IV"; 1.3.1794-03 "Organização do trabalho durante a pesquisa de PCR de material infectado com microrganismos dos grupos de patogenicidade I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Desinfecção de material de teste infectado com bactérias dos grupos de patogenicidade I-IV ao trabalhar com o método de PCR", 2001. Apêndice 11 das Instruções sobre métodos unificados de pesquisa microbiológica na detecção, diagnóstico e tratamento da tuberculose.

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Funcionários

Estudos biológicos moleculares podem ser realizados por médicos de diagnóstico laboratorial clínico, bacteriologistas, virologistas, biólogos de laboratório de diagnóstico clínico, bem como por especialistas com formação médica secundária que tenham passado por especialização e treinamento avançado da maneira estabelecida.

Arranjo das instalações do laboratório

As seguintes instalações laboratoriais são necessárias:

• Área de processamento de amostras - laboratório adaptado para trabalhar com agentes infecciosos dos grupos de patogenicidade III-IV, de acordo com as Diretrizes Metodológicas 13.1888-04.
• A área para preparação de misturas de reação de PCR é uma sala de laboratório que fornece proteção contra contaminação interna do laboratório - uma área “limpa”.
• • Se a eletroforese ou a hibridização forem utilizadas para analisar produtos de PCR, a sala do laboratório na qual os fragmentos de DNA amplificados são extraídos do tubo de amplificação e, portanto, podem entrar no ambiente, de acordo com os requisitos para laboratórios de PCR (Diretrizes Metodológicas 1.3.1794-03, Diretrizes Metodológicas 1.3.1888-04), deve ser completamente isolada das salas especificadas nos parágrafos anteriores. A movimentação de qualquer pessoa, equipamento, materiais e objetos da área de eletroforese para a área de processamento de amostras e para a área "limpa", bem como a transferência de ar através do sistema de ventilação ou como resultado de correntes de ar, deve ser excluída. Esta área não é necessária para a detecção fluorimétrica de produtos de PCR.
• A sala de documentação e processamento de resultados está equipada com computadores e os equipamentos de escritório necessários. Esta sala pode conter equipamentos que garantam a detecção de produtos de PCR sem necessidade de abertura do tubo. - detectores de PCR fluorescentes e termocicladores para PCR em tempo real.

Os requisitos sanitários e epidemiológicos para o processamento primário de escarro são semelhantes aos requisitos microbiológicos padrão para trabalhar com Mycobacterium tuberculosis.

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Conjunto completo de equipamentos de laboratório para diagnóstico de PCR

O kit de laboratório inclui equipamentos para as seguintes salas.

• sala de preparação de amostras, contém os seguintes equipamentos: capela de fluxo laminar de classe de proteção II "SP-1.2": termostato de estado sólido com tampa aquecida para tubos de ensaio Eppendorf; microcentrífuga a 13.000 rpm; centrífuga ("Vortex"); refrigerador com faixa de temperatura de -20 ^° C a +10 ^° C; pipetas de volume variável da série "Proline"; bomba com frasco coletor OM-1; suporte para pipetas; suporte para estação de trabalho 200x0,5 ml; suporte para estação de trabalho 50x1,5 ml; suportes para armazenamento de tubos de ensaio 80x1,5 ml;
• sala de preparação da mistura de reação: câmara protetora caixa PCR ("Laminar-C. 110 cm); centrífuga "Vortex"; pipetas de volume variável da série "Proline"; suporte para pipetas; suporte para estação de trabalho 200x0,2 ml; suportes para armazenamento de tubos de ensaio 80x1,5 ml; refrigerador com faixa de temperatura de -20 ^° C a +10 ^° C;
• Sala de eletroforese: câmara de eletroforese horizontal; fonte de energia; transiluminador;
• Amplificador de DNA ou analisador de ácido nucleico (PCR em tempo real) com computador e software; pode ser instalado em qualquer sala disponível. Se for utilizada a tecnologia de PCR em tempo real, não é necessária uma sala de eletroforese.

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Controle de qualidade externo

Para garantir que obtenham resultados objetivamente confiáveis, os laboratórios devem participar de um sistema de avaliação externa da qualidade da pesquisa laboratorial.

Os participantes do sistema de controle de qualidade recebem: 12 ampolas com suspensões liofilizadas de células bacterianas, duas das quais contêm E. coli, 3 ampolas com micobactérias da tuberculose (cepa avirulenta) na concentração de 10 ² /ml; 3 ampolas com células de uma cepa semelhante na concentração de 10 ⁴ /ml; 2 ampolas cada uma com micobactérias não tuberculosas M. avium-intracellulare e M. kansasii na concentração de 10 ⁵ /ml.

Os testes enviados para avaliação externa de qualidade são pré-testados em dois laboratórios independentes com ampla experiência nesta área.

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