Um frasco, dois alvos: diagnóstico portátil de tuberculose baseado em CRISPR com 100% de sensibilidade

Um artigo sobre um teste portátil para tuberculose que pode ser feito diretamente do escarro, sem equipamento complexo, foi publicado na Science Advances. A amplificação isotérmica de DNA e a leitura CRISPR são combinadas em um único tubo de ensaio; duas inserções conservadoras de M. tuberculosis (IS6110 e IS1081) são testadas simultaneamente, além de um gene humano como controle interno da amostra. Em um pequeno teste "cego" em amostras clínicas, o teste apresentou 100% de sensibilidade (6/6) e 100% de especificidade (7/7) em comparação com a cultura; o limite de detecção é de ~69–81 UFC/ml no escarro simulado. O resultado pode ser visto em uma tira de teste de papel, e os reagentes são liofilizados (armazenamento sem "cadeia de frio").

Fundo

Segundo a OMS, a tuberculose matará cerca de 1,25 milhão de pessoas em 2023; a tuberculose voltou a ser a principal causa infecciosa de morte, com uma estimativa de 10,8 milhões de casos. Isso torna o diagnóstico acessível e rápido essencial, especialmente em ambientes com recursos limitados.

• Os testes atuais representam um meio-termo entre precisão, velocidade e preço. A cultura "padrão ouro" é muito precisa, mas lenta; a microscopia é rápida, mas insensível; plataformas de PCR como Xpert MTB/RIF Ultra são significativamente mais sensíveis (LOD ≈ 15,6 UFC/ml), mas exigem equipamentos e cartuchos caros, o que limita a cobertura.
• Por que isotérmico e CRISPR? A amplificação isotérmica de RPA funciona a 37–42 °C e não requer termocicladores — conveniente "em campo". A leitura de CRISPR (Cas12/13) adiciona especificidade de espécie e permite fluxo lateral visual ("faixa") sem óptica complexa. Em suma, este é o caminho para testes de PVR portáteis e baratos.
• Por que dois alvos MBT simultaneamente (IS6110 + IS1081)? IS6110 é uma inserção multicópia do complexo M. tuberculosis, mas algumas linhagens têm poucas cópias, e os testes para IS6110 isoladamente podem "errar". Adicionar uma segunda inserção IS1081 reduz o risco de resultados falso-negativos.
• Por que o controle humano interno? Amostras respiratórias podem conter inibidores e amostras "ruins". O controle humano endógeno (por exemplo, RNase P/DNA genômico) confirma que o material é adequado e que a reação não é suprimida – caso contrário, o resultado não pode ser considerado negativo.
• O formato de um recipiente é importante por si só. Ele reduz etapas, reduz o risco de contaminação e facilita o trabalho fora do laboratório. Tais abordagens para tuberculose já demonstraram viabilidade; o novo trabalho estende a ideia para um formato de alvo duplo com controles internos, além de demonstrar a liofilização de reagentes e um leitor de tiras.
• Qual é o valor do artigo atual? Os autores demonstraram a detecção diretamente no escarro após a preparação de amostra mais simplificada, o limite de detecção em ~70–80 UFC/ml no escarro simulado e 100% de sensibilidade/especificidade em um pequeno conjunto cego de amostras clínicas — uma boa "demonstração tecnológica" para futuras validações multicêntricas.

Como é que isso funciona

• Os cientistas combinaram RPA (amplificação isotérmica rápida de material genético a 37 °C) com as enzimas de "corte" Cas13a/Cas12a. Após selecionar os RNAs-guia, configuraram o sistema para atingir dois alvos de MBT simultaneamente e em paralelo ao DNA humano (verificando se há material na amostra e se a reação não "parou").
• Toda a química vai para um tubo de ensaio; após a incubação, o resultado é lido com um fluorímetro ou em uma tira de fluxo lateral — essencialmente como um teste rápido.
• O processamento do escarro foi simplificado para aquecimento e uma breve centrifugação — sem extratores de ácido nucleico. Para as condições mais limitadas, os autores até discutem alternativas manuais à centrífuga.

O que os testes mostraram

• Limite de detecção: 69,0 UFC/ml (cepa H37Rv) e 80,5 UFC/ml (BCG) no escarro "spike". Não foi detectada reatividade cruzada com outras bactérias/fungos.
• Ambiente clínico (amostras cegas): em 13 amostras da prática real - 100% de sensibilidade (6/6) e 100% de especificidade (7/7) em relação à semeadura. Para comparação, no mesmo kit, o GeneXpert Ultra apresentou 100%/86%, respectivamente.
• Nuances técnicas: das duas opções de leitura, a Cas13a funcionou melhor (para o formato "one-pot", é mais sensível que a Cas12a). Além disso, o teste paralelo de dois alvos de MTB reduz o risco de resultados falsos.

Por que isso é necessário?

Os testes atuais são um meio-termo entre precisão, velocidade e disponibilidade: a cultura é muito precisa, mas lenta; os swabs são rápidos, mas imprecisos; sistemas de PCR como o GeneXpert são precisos e rápidos, mas exigem instrumentos e cartuchos caros. A nova abordagem CRISPR visa preencher essa lacuna: diagnósticos de campo que operam a 37 °C, com leituras em tiras de papel e a possibilidade de armazenar reagentes sem refrigeração.

Limitações e o que vem a seguir

Esta é uma demonstração inicial em um pequeno conjunto clínico – são necessários testes amplos e multicêntricos (incluindo coinfecção por HIV, em crianças, com formas paucibacilares e diferentes linhagens de MBT). Os autores observam separadamente que, na versão de "campo", a centrífuga de mesa terá que ser substituída por uma solução totalmente manual. Mas a arquitetura em si – "dois alvos + controle interno" em um tubo de ensaio – já comprovou sua operabilidade e fornece um caminho claro para o refinamento para uso em massa.

Fonte: Alexandra G. Bell et al. Um teste simplificado baseado em CRISPR para detecção de tuberculose diretamente do escarro, Science Advances, online, 6 de agosto de 2025 (Vol. 11, Edição 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206